Análisis de la expresión de genes para la caracterización e identificación de compuestos genotóxicos.

Método para someter a ensayo un compuesto para actividad genotóxica y/o pro-genotóxica,

que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto dicho compuesto a ser sometido a ensayo con un sistema celular de ensayo que exprese al menos un panel de genes, que son GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A, en donde el sistema se selecciona del grupo de células únicas, cultivos celulares, tejidos, órganos y mamíferos no humanos; y

(b) detectar y cuantificar la expresión de dicho panel de genes en dicho sistema de ensayo, en donde la expresión génica se correlaciona con una cantidad de señal o cambio en la señal, y comparar la expresión de dicho panel de genes en dicho sistema de ensayo con la expresión de dicho panel de genes en un sistema de control celular negativo, en donde una regulación por incremento de la expresión de dicho panel de genes en dicho sistema de ensayo, comparada con la expresión de dicho panel de genes en dicho sistema de control, indica que dicho compuesto tiene actividad genotóxica y/o pro-genotóxica.

Análisis de la expresión de genes para la caracterización e identificación de compuestos genotóxicos La presente invención hace referencia a un método para el cribado de compuestos con actividad (pro-) genotóxica, proporcionando un sistema celular que es capaz de expresar al menos un panel de 11 genes definidos, incubando al menos una parte del sistema con compuestos a ser cribados, y comparando la expresión de los genes en el sistema con la expresión de genes en un sistema celular de control, detectando de este modo la actividad (pro-) genotóxica. Otro objeto de la invención está relacionado con un método para la monitorización de condiciones fisiológicas y/o patológicas, que están causadas, se encuentran mediadas o se propagan por la desregulación genética de la proliferación, diferenciación y/o reparación de daños, mediante la administración de una cantidad efectiva de al menos un único compuesto (pro-) genotóxico a un mamífero en necesidad de tal tratamiento, y la determinación de una expresión de 11 genes definidos en una muestra biológica tomada del mamífero. La invención hace referencia además a matrices para el cribado de compuestos con actividad (pro-) genotóxica que comprenden sondas de ácido nucleico que hibridizan de manera específica bajo condiciones rigurosas con los genes marcadores de la Tabla 1, Figura 1, Figura 1a+b y/o Figura 2 a+b.

Los ensayos de genotoxicidad son una parte importante de la estrategia de ensayos estándar dentro del desarrollo farmacéutico y para la evaluación de riesgos de sustancias químicas. Para reflejar diversos mecanismos de acción genotóxicos, los ensayos estándar implican batería de pruebas de la mutagenicidad en las bacterias y de las propiedades del daño cromosómico a células de mamíferos in vitro y/o in vivo.

Recientemente, las investigaciones de mecanismos han ganado interés de manera significativa -en particular dentro del alcance actual de la evaluación de riesgos de sustancias genotóxicas y carcinógenas, y para la caracterización química dentro del programa de regulación REACH de la UE. Las tecnologías “ómicas” de la biología integrativa se encuentran opuestas al enfoque clásico, reduccionista de las medidas de criterio de valoración único, mediante la generación de una visión de conjunto de los mecanismos celulares a través del registro de todos los componentes en un sistema dado.

En los últimos años, se han publicado los primeros estudios que aplican la Toxicogenómica (TXG) para la evaluación de la genotoxicidad y la carcinogenicidad, y han demostrado firmas de la expresión de genes solapados para diferentes hepatocarcinógenos genotóxicos en ratas que eran distintos a los de hepatocarcinógenos no genotóxicos, y fue posible clasificar correctamente sustancias desconocidas con una precisión del 75-88% mediante un modelo de clasificación construido a partir de datos de hepatocarcinógenos bien descritos (Ellinger-Ziegelbauer et al., 2008, Mutat. Res. 637, 23-39) . En 2006, se creó el proyecto carcinoGENÓMICA para desarrollar alternativas a los bioensayos de la carcinogenicidad en el ciclo de vida de roedores in vitro.

A pesar de ser altamente sensibles, los ensayos con células de mamíferos están limitados por su baja especificidad, lo que produce una elevada tasa de falsos positivos y que a su vez complica la interpretación de los resultados. Los resultados de falsos positivos complican la extrapolación del peligro para humanos e inicia una serie de laboriosos ensayos de seguimiento in vitro y/o in vivo lo que fomenta el desarrollo de nuevas herramientas in vitro.

Los esfuerzos para reducir la tasa de falsos positivos se ven reflejados en el desarrollo de una nueva guía ICH S2 (R1) , y la consideración de las combinaciones de ensayos más efectivos de los ensayos estándar. Las dificultades están forzando ahora el desarrollo de nuevas herramientas in vitro.

Por lo tanto, el problema técnico que forma la base de la presente invención es proporcionar un método para el cribado de compuestos, que permitan de manera efectiva la identificación y caracterización de sus propiedades genotóxicas y/o pro-genotóxicas. Es otro problema de la presente invención proporcionar una matriz para la detección de actividad genotóxica y/o pro-genotóxica, que haga posible una monitorización sencilla y rápida de enfermedades dependientes de genotoxicidad.

La presente invención resuelve el problema proporcionando un método para el cribado de compuestos con actividad genotóxica o pro-genotóxica que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un sistema celular o una muestra del mismo capaz de expresar al menos los genes GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A, en donde el sistema se selecciona del grupo de células únicas, cultivos celulares, tejidos, órganos y mamíferos o una muestra de los mismos,

(b) incubar al menos una parte del sistema con compuestos a ser cribados, y

(c) detectar la actividad genotóxica y/o pro-genotóxica mediante análisis de la expresión de genes, en donde la expresión de dichos genes en el sistema se compara con la expresión de genes en un sistema celular de control.

Sorprendentemente, se ha demostrado por parte de los inventores que el mencionado grupo de al menos 11 genes está correlacionado con la genotoxicidad. Consecuentemente, la mencionada pluralidad de genes marcadores representa nuevos genes diana de genotoxicidad, los cuales, tanto ellos mismos como sus productos génicos, respectivamente, son dianas perfectamente adecuadas para la diferenciación de la etapa de genotoxicidad. Los genes subyacentes se seleccionan como resultado de un análisis de expresión diferencial. Los genes identificados no se asocian, inevitablemente, mediante función o localización en su entidad tal como se conoce actualmente, pero no se excluye que aparezcan tales relaciones entre un único miembro o más miembros del grupo. En lugar de ello, todos los genes se caracterizan por una diferencia distintiva con las células no tratadas, lo que se muestra bien mediante una regulación por incremento o mediante represión. Los genes ya se encuentran descritos en el estado del arte mediante secuencias y otras características, pero careciendo de una conexión con la genotoxicidad, ya sea en solitario o en la combinación definida de la invención. Cualquiera de los 11 genes marcadores o genes marcadores suplementarios de acuerdo a la tabla 1 pueden ser utilizados para la mayor fiabilidad del ensayo. Los genes pueden ser nombrados de otra manera, pero se asignan fácilmente mediante su número de accesión, que es en general aceptado y se encuentra fijado en numerosas bases de datos, tales como la GenBank, SwissProt y similares.

Los inventores han identificado, de forma inesperada, procesos de regulación de genes característicos relacionados con el daño al ADN inducido por los compuestos de ensayo (pro-) genotóxicos, en particular compuestos genotóxicos. Se proporciona una visión general exhaustiva de la red de respuesta al daño en el ADN (Figura 7) . Aunque STAT1, SP1 y P53 no se regulan por sí mismos a nivel de la expresión génica, la regulación de genes diana indicó una activación de estos moduladores de la transcripción en respuesta al tratamiento con genotóxicos. La actividad de estos factores de transcripción se regula de forma crucial mediante la fosforilación de proteínas que puede ser inducida por múltiples señales, que incluyen estrés celular en general, daño del ADN o interferones.

P53 se eleva de manera significativa en respuesta a los compuestos de ensayo genotóxicos y pro-genotóxicos. El mecanismo de los compuestos de ensayo genotóxicos ETO, MMS, y ACT conduce a la activación de p53 y a la mediación de la respuesta a la señalización de p53 (Figura 8) . La dosis de ACT que induce la inhibición de p53 está en correlación con las dosis necesitadas para la inhibición de la síntesis del ARNm. Más aún, la relativamente poco frecuente tasa de roturas de la cadena de ADN a dosis elevadas de ACT indicó que la inhibición de la topoisomerasa es de importancia secundaria para la acumulación de p53. El mecanismo de activación de p53 puede ser visto como una función sensorial de la ARN polimerasa II bloqueada por ACT (POLR2) o con factores de transcripción asociados de estas polimerasa. Se observó una regulación por disminución de la topoisomerasa II (TOPO2) y de la ARN polimerasa II por parte de ACT (Figura 8) . Además, la carencia de la función mdm2, además de la activación de APAK (proteína KZNF asociada a ATM y P53) – un regulador de p53 descubierto recientemente -, sugiere un papel para la inducción de p53 mediada por ACT, MMS y presumiblemente también para... [Seguir leyendo]

1. Método para someter a ensayo un compuesto para actividad genotóxica y/o pro-genotóxica, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto dicho compuesto a ser sometido a ensayo con un sistema celular de ensayo que exprese al menos un panel de genes, que son GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A, en donde el sistema se selecciona del grupo de células únicas, cultivos celulares, tejidos, órganos y mamíferos no humanos; y

(b) detectar y cuantificar la expresión de dicho panel de genes en dicho sistema de ensayo, en donde la expresión génica se correlaciona con una cantidad de señal o cambio en la señal, y comparar la expresión de dicho panel de genes en dicho sistema de ensayo con la expresión de dicho panel de genes en un sistema de control celular negativo, en donde una regulación por incremento de la expresión de dicho panel de genes en dicho sistema de ensayo, comparada con la expresión de dicho panel de genes en dicho sistema de control, indica que dicho compuesto tiene actividad genotóxica y/o pro-genotóxica.

2. Método según la reivindicación 1, en donde en la etapa (a) dicho compuesto a ser sometido a ensayo se administra a un mamífero no humano, y en la etapa (b) la expresión de dicho panel de genes en una muestra biológica tomada del mamífero no humano, es comparada con la expresión de dicho panel de genes en una muestra biológica tomada de un mamífero no humano que no muestra efectos genotóxicos, en donde dicha regulación por incremento indica una probabilidad aumentada de que dicho compuesto tenga un efecto terapéutico para una condición patológica mediada por genotoxicidad.

3. Método para la monitorización de la probabilidad de respuesta a un tratamiento contra el cáncer, tumores, metástasis o trastornos de angiogénesis, que son causados, mediados y/o propagados por la desregulación de la proliferación, diferenciación y/o reparación de daño, en donde los niveles de expresión de al menos un panel de genes, que son GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A, se determinan en una muestra biológica tomada de un mamífero en necesidad de tal tratamiento con al menos un compuesto genotóxico o pro-genotóxico, o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, que se administró a dicho mamífero, en donde un nivel de regulación por incremento indica una probabilidad aumentada de que dicho mamífero responda al tratamiento con dicho compuesto.

4. Uso de un panel de genes, que son GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A, como genes marcadores para someter a ensayo un compuesto para actividad genotóxica y/o pro-genotóxica.

5. Uso de sondas de ácido nucleico que hibridan específicamente bajo condiciones rigurosas con un panel de genes, que son GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A, o productos génicos codificados por dicho panel de genes, o respectivas partes de los mismos, para detectar y cuantificar la expresión de dicho panel de genes, que es representativo para una respuesta genotóxica y/o pro-genotóxica en un sistema celular.

6. Matriz para someter a ensayo un compuesto para actividad genotóxica y/o pro-genotóxica, que comprende sondas de ácido nucleico que hibridan específicamente bajo condiciones rigurosas con un panel de genes, que son GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A, o productos génicos codificados por dicho panel de genes, o respectivas partes del mismo.