Amplificación de sondas dependiente de ligamiento químico (CLPA).

Un método que comprende:

a) proporcionar

i. un sustrato de ligamiento que comprende una secuencia de ácido nucleico diana que comprende

al menos un primer dominio diana y un segundo dominio diana,

en el que el ácido nucleico diana es una muestra bruta;

ii. una primera sonda de ligamiento; y

iii. una segunda sonda de ligamiento,

en el que la primera sonda de ligamiento comprende un primer dominio de sonda sustancialmente complementario del primer dominio de diana y un resto de ligamiento 5'; en el que la segunda sonda de ligamiento comprende un segundo dominio de sonda sustancialmente complementario del segundo dominio de diana y un resto de ligamiento 3'; y en el que una o ambas de las sondas contienen una secuencia espaciadora variable con longitudes diferentes para cada secuencia de ácido nucleico diana;

b) ligar la primera y segunda sondas de ligamiento en ausencia de enzima ligasa añadida exógenamente, formando un producto de ligamiento; en el que el producto de ligamiento tiene una longitud específica de diana que surge de la secuencia espaciadora variable, en el que el ligamiento ocurre en presencia de proteinasa K;

c) amplificar el producto de ligamiento; y

d) detectar el producto de ligamiento.

Amplificaciïn de sondas dependiente de ligamiento quïmico (CLPA)

CAMPO DE LA INVENCIïN

Esta invenciïn se refiere a mïtodos para detectar ïcidos nucleicos en una muestra usando ligamiento quïmico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIïN

Esta invenciïn se refiere a mïtodos para detectar una o mïs dianas de ïcido nucleico presentes en una muestra. La detecciïn de ïcidos nucleicos especïficos es una herramienta importante para la medicina de diagnïstico y la investigaciïn en biologïa molecular.

Los ensayos de sonda gïnica desempeïan actualmente papeles en la identificaciïn de organismos infecciosos tales como bacterias y virus, en el sondeo de la expresiïn de genes normales y mutantes y en la identificaciïn de genes asociados a enfermedad o lesiïn, tales como oncogenes, en el tipado de tejido para compatibilidad antes del trasplante de tejido, en la comparaciïn de muestras de tejido o sangre para medicina forense, para responder ante situaciones de respuesta a emergencias como un incidente nuclear o un brote de gripe pandïmico, en la determinaciïn del pronïstico o causa de una enfermedad y para explorar la homologïa entre genes de diferentes especies.

Idealmente, un ensayo de sonda gïnica deberïa ser sensible, especïfico y fïcilmente automatizable (para una revisiïn, vïase Nickerson, en Current Opinion in Biotechnology (1993) 4:48-51.) El requisito de sensibilidad (concretamente, bajos lïmites de detecciïn) se ha aliviado en gran medida por el desarrollo de la reacciïn en cadena de la polimerasa (PCR) y otras tecnologïas de amplificaciïn que permiten a los investigadores amplificar exponencialmente una secuencia de ïcido nucleico especïfica antes del anïlisis (para una revisiïn, vïase Abramson et al., Current Opinion in Biotechnology, (1993) 4:41-47) . Por ejemplo, se ha mostrado que la amplificaciïn por PCR mïltiple de loci de SNP con hibridaciïn posterior con matrices oligonucleotïdicas es un mïtodo exacto y fiable de genotipado simultïneo de cientos de SNP (vïase Wang et al., Science, (1998) 280:1077; vïase tambiïn Schafer et al., Nature Biotechnology, (1989) 16:33-39) .

La especificidad sigue siendo tambiïn un problema en muchos ensayos de sonda gïnica actualmente disponibles. La extensiïn de la complementariedad molecular entre sonda y diana define la especificidad de la interacciïn. Las variaciones en la composiciïn y concentraciïn de las sondas, dianas y sales en la reacciïn de hibridaciïn, asï como la temperatura de reacciïn y longitud de la sonda, pueden alterar todas la especificidad de la interacciïn sonda/diana.

Puede ser posible en algunas circunstancias distinguir las dianas con complementariedad perfecta de las dianas con desapareamientos, aunque esto es generalmente muy difïcil usando la tecnologïa tradicional, puesto que pequeïas variaciones en las condiciones de reacciïn alterarïn la hibridaciïn. Las tïcnicas mïs nuevas con la especificidad necesaria por detecciïn de desapareamientos incluyen los ensayos de digestiïn de sonda en que los desapareamientos crean sitios para escisiïn de sonda, y los ensayos de ligamiento de ADN en que los desapareamientos de un solo punto evitan el ligamiento.

Estïn disponibles una variedad de mïtodos enzimïticos y no enzimïticos para detectar variaciones de secuencia. Los ejemplos de mïtodos basados en enzimas incluyen el ensayo de ligamiento de oligonucleïtidos (OLA) Invader™, mïtodos de extensiïn de una sola base, PCR alïlica y anïlisis de sonda competitiva (por ejemplo, secuenciaciïn competitiva por hibridaciïn) . Las reacciones de ligamiento de ADN enzimïtico son bien conocidas en la materia (Landegren, Bioessays (1993) 15 (11) : 761-5; Pritchard et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25 (17) : 3403-7; Wu et al., Genomics, (1989) 4 (4) : 560-9) y se han usado ampliamente en la detecciïn de SNP, reacciones de amplificaciïn enzimïtica y reparaciïn de ADN.

Se han desarrollado una serie de mïtodos de ligamiento quïmico no enzimïticos o mediados por molde que pueden usarse para detectar variaciones de secuencia. Estos incluyen mïtodos de ligamiento quïmico que utilizan reactivos de acoplamiento tales como N-cianoimidazol, bromuro de cianïgeno e hidrocloruro de 1-etil-3- (3dimetilaminopropil) carbodiimida. Vïanse Metelev, V.G., et al., Nucleosides & Nucleotides (1999) 18: 2711; Luebke,

K.J. y Dervan, P.B. J. Am. Chem. Soc. (1989) 111: 8733; y Shabarova, Z.A., et al., Nucleic Acids Research (1991)

19: 4247.

Kool (patente de EE.UU. nï 7.033.753) describe el uso de ligamiento quïmico y transferencia de energïa de resonancia de fluorescencia (FRET) para detectar polimorfismos genïticos. La lectura en este proceso estï basada en el cambio de intensidad de fluorescencia en la fase de disoluciïn.

El documento WO 2007/133703 describe el uso de mïtodos de ligamiento quïmico, composiciones y reactivos para la detecciïn de ïcidos nucleicos mediante la detecciïn de micromatrices.

Otros mïtodos de ligamiento quïmico hacen reaccionar un grupo 5'-tosilato o 5'-yodo con un grupo 3'-fosforotioato, dando como resultado una estructura de ADN en que un azufre reemplaza a uno de los ïtomos de oxïgeno del puente fosfodiïster. Vïanse Gr y anov, S.M. y Letsinger, R.L., Nucleic Acids Research (1993) 21:1403; Xu, Y. y Kool,

E.T. Tetrahedron Letters (1997) 38: 5595; y Xu, Y. y Kool, E.T., Nucleic Acids Research (1999) 27: 875.

Algunas de las ventajas de usar enfoques no enzimïticos para la detecciïn de dianas de ïcido nucleico incluyen la menor selectividad por estructuras anïlogas a ADN no natural, la capacidad de usar secuencias diana de ARN, el menor coste y la mayor robustez en diversas condiciones. Letsinger et al . (patente de EE.UU. nï 5.780.613) han descrito anteriormente un autoligamiento covalente no enzimïtico irreversible de oligonucleïtidos unidos a molde adyacentes en el que un oligonucleïtido tiene un grupo 5' desplazable y el otro oligonucleïtido tiene un grupo 3' tiofosforilo.

Las solicitudes PCT WO 95/15971, WO96/40712 y WO98/20162 describen composiciones novedosas que comprenden ïcidos nucleicos que contienen restos de transferencia de electrones, incluyendo electrodos, que permiten mïtodos novedosos de detecciïn de la hibridaciïn de ïcido nucleico.

Una tecnologïa que ha ganado una relevancia aumentada implica el uso de matrices de ADN (Marshall et al., Nat. Biotechnol. (1998) 16 (1) : 27-31) , especialmente para aplicaciones que implican la medida simultïnea de numerosas dianas de ïcido nucleico. Las matrices de ADN se usan lo mïs a menudo para la monitorizaciïn de la expresiïn gïnica, en que se mide simultïneamente la concentraciïn relativa de 1 a 100.000 dianas de ïcido nucleico (ARNm) . Las matrices de ADN son pequeïos dispositivos en que se enlazan sondas de anclaje de ïcido nucleico a una superficie con un patrïn que es distinto y conocido en el momento de la fabricaciïn (Marshall et al., Nat Biotechnol. (1998) 16 (1) : 27-31) o pueden descifrarse exactamente en un momento posterior, tal como es el caso de las matrices de perla (Steemers et al., Nat Biotechnol. (2000) 18 (1) : 91-4; y Yang et al., Genome Res. (2001) 11 (11) : 1888-98.) . Despuïs de una serie de etapas de procesamiento previas, se pone en contacto la muestra de interïs con la matriz de ADN, las dianas de ïcido nucleico en la muestra hibridan con los oligonucleïtidos anclados sobre la superficie y se determinan la identidad, y a menudo la concentraciïn, de los ïcidos nucleicos diana en la muestra.

Muchos de los mïtodos de detecciïn de ïcido nucleico en uso actualmente tienen caracterïsticas y/o limitaciones que dificultan su aplicabilidad amplia. Por ejemplo, en el caso de micromatrices de ADN, antes de poner en contacto una muestra con la micromatriz, existen habitualmente una serie de etapas de procesamiento que deben efectuarse en la muestra. Aunque estas etapas varïan dependiendo del fabricante de la matriz y/o de la tecnologïa que se use para leer la matriz (fluorescencia, electroquïmica, quimioluminiscencia, magnetorresistencia, deflexiïn de micropalanca, resonancia de plasmïn de superficie) , estas etapas de procesamiento entran habitualmente dentro de algunas categorïas generales: Aislamiento y purificaciïn de ïcido nucleico, amplificaciïn enzimïtica, incorporaciïn de marcador detectable y limpiado postamplificaciïn. Son otras etapas comunes la concentraciïn de muestra, la fragmentaciïn de diana amplificada para reducir el tamaïo medio de la diana de ïcido nucleico y la digestiïn con exonucleasa para convertir las dianas amplificadas por PCR en especies monocatenarias.

El requisito de muchas etapas de procesamiento previas antes de poner en contacto la matriz... [Seguir leyendo]

1. Un mïtodo que comprende: a) proporcionar

i. un sustrato de ligamiento que comprende una secuencia de ïcido nucleico diana que comprende al menos un primer dominio diana y un segundo dominio diana, en el que el ïcido nucleico diana es una muestra bruta;

ii. una primera sonda de ligamiento; y

iii. una segunda sonda de ligamiento,

en el que la primera sonda de ligamiento comprende un primer dominio de sonda sustancialmente complementario del primer dominio de diana y un resto de ligamiento 5'; en el que la segunda sonda de ligamiento comprende un segundo dominio de sonda sustancialmente complementario del segundo dominio de diana y un resto de ligamiento 3'; y en el que una o ambas de las sondas contienen una secuencia espaciadora variable con longitudes diferentes para cada secuencia de ïcido nucleico diana;

b) ligar la primera y segunda sondas de ligamiento en ausencia de enzima ligasa aïadida exïgenamente,

formando un producto de ligamiento; en el que el producto de ligamiento tiene una longitud especïfica de diana que surge de la secuencia espaciadora variable, en el que el ligamiento ocurre en presencia de proteinasa K;

c) amplificar el producto de ligamiento; y

d) detectar el producto de ligamiento.

2. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en el que una o ambas de las sondas de ligamiento comprenden una secuencia cebadora.

3. El mïtodo de la reivindicaciïn 1 o 2, en el que la secuencia de ïcido nucleico diana es ARN.

4. El mïtodo de las reivindicaciones 1, 2 o 3, en el que las sondas de ligamiento son de ADN.

5. El mïtodo de cualquier reivindicaciïn precedente, en el que la muestra bruta comprende sangre completa.

6. El mïtodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra bruta comprende una muestra embebida en parafina.

7. El mïtodo de cualquier reivindicaciïn precedente, en el que el producto de ligamiento se detecta por electroforesis capilar.

8. El mïtodo de cualquier reivindicaciïn precedente, en el que el producto de ligamiento se detecta usando un 30 espectrïmetro de masas.

9. El uso de una etapa de ligamiento efectuada en ausencia de enzima ligasa aïadida exïgenamente en la detecciïn de una pluralidad de ïcidos nucleicos diana en una muestra; comprendiendo el uso las etapas de:

a) proporcionar una muestra que comprende un sustrato de ligamiento, comprendiendo el sustrato los ïcidos nucleicos diana, cuyas secuencias comprenden al menos un primer dominio diana y un segundo dominio diana, en el que los ïcidos nucleicos diana estïn en una muestra bruta;

b) proporcionar

i. una primera sonda de ligamiento; y

ii. una segunda sonda de ligamiento,

en el que la primera sonda de ligamiento comprende un primer dominio de sonda sustancialmente complementario del primer dominio de diana y un resto de ligamiento 5'; en el que la segunda sonda de ligamiento comprende un segundo dominio de sonda sustancialmente complementario del segundo dominio de diana y un resto de ligamiento 3'; y en el que una o ambas de las sondas contienen:

una secuencia espaciadora variable con longitudes diferentes para cada secuencia de ïcido nucleico diana;

c) efectuar la etapa de ligamiento ligando las primeras y segunda sondas de ligamiento con el sustrato de 45 ligamiento en ausencia de enzima ligasa aïadida exïgenamente, formando un producto de ligamiento; en el

que el producto de ligamiento tiene una longitud especïfica de diana que surge de la secuencia espaciadora variable, en el que la etapa de ligamiento ocurre en presencia de proteinasa K; d) amplificar el producto de ligamiento; y e) detectar el producto de ligamiento.

10. La materia de cualquier reivindicaciïn precedente, en la que el ligamiento ocurre espontïneamente sin la adiciïn de reactivos ni estïmulos adicionales.