Alérgeno producido de manera recombinante.

Un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 2.

Alérgeno producido de manera recombinante Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la alergia. Más específicamente, la invención se refiere a la identificación de nuevos alérgenos de mamíferos y al diagnóstico y tratamiento de la alergia a mamíferos.

Antecedentes La caspa de perro es una causa común de alergia de interiores con síntomas que incluyen rinitis, conjuntivitis, inflamación bronquial y asma. Los alérgenos de perro se pueden detectar no sólo en las viviendas donde los perros son mantenidos como mascotas, sino también en otros lugares, como escuelas y centros de día donde los perros no están presentes de forma regular [1].

La alergia al perro se acompaña y depende de la sensibilización a las proteínas liberadas por pelos y caspa de perro. En los casos de sospecha de alergia a perros, la investigación clínica incluye la evaluación de la sensibilización por el pinchazo de la piel o la medición de anticuerpos IgE específicos utilizando extracto de pelo y/o caspa de perro. Un inmunoanálisis de laboratorio para IgE específica, tal como Phadia ImmunoCAP™, puede detectar la mayoría de los casos de sensibilización a perro utilizando extracto natural de caspa de perro, debido a las favorables condiciones de análisis y a una gran fase sólida disponible para el anclaje del alérgeno.

Los extractos de pelo y caspa de perro contienen una complejidad de proteínas alergénicas y no alergénicas [2, 3]. Hasta ahora se han identificado y estudiado en detalle cuatro alérgenos de perro: Can f 1, Can f 2, Can f 3 y Can f 5 [4-6]. Los dos primeros son ambos miembros de la familia de proteínas de lipocalina y se han purificado y expresado como proteínas recombinantes [4, 7]. Can f 3, albúmina de suero perro, es una proteína relativamente conservada que muestra considerable reactividad cruzada con otras albúminas de mamíferos [8]. Can f 5, calicreína prostática de perro, se ha descrito recientemente como un alérgeno principal de perro y muestra reacción cruzada con el antígeno específico de próstata humano (PSA) [5].

De los alérgenos de caspa de perro conocidos hasta la fecha, Can f 1 y Can f 5 parecen ser los más importantes, uniéndose a anticuerpos IgE de aproximadamente 50% y 70% de los sujetos alérgicos al perro, respectivamente [5, 9]. Aunque aproximadamente 20-40% de los individuos adultos alérgicos al perro presenta unión del anticuerpos IgE a Can f 2 o Can f 3, pocos parecen reaccionar exclusivamente o incluso predominantemente a cualquiera de estos alérgenos [5, 9]. En un estudio recientemente referido, se encontró que una pequeña proporción de pacientes alérgicos al perro no presentaba unión del anticuerpo IgE a ninguno de Can f 1, Can f 2, Can f 3 y Can f 5, a pesar de estar sensibilizados a extracto de caspa natural de perro [5].

Además de los alérgenos mencionados anteriormente, se ha informado sobre una proteína de tipo lipocalina de 18 kDa, reactiva con IgE, distinta de Can f 1 y Can f 2, y se ha denominado Can f 4 [9]. Se informó de que 15 de 25 (60%) pacientes alérgicos al perro presentaban reactividad de IgE en suero con esta banda de 18 kDa en la inmunotransferencia, haciendo de ésta un componente potencialmente importante de alérgeno perro. Sin embargo, el alérgeno sólo se ha caracterizado como una secuencia N-terminal de 13 de aminoácidos a partir de un gel de SDS PAGE, una secuencia que no produce emparejamientos con ninguna otra secuencia de proteína conocida de perro. La secuencia de proteína completa es por tanto desconocida, y no se ha llevado a cabo la clonación de una proteína recombinante. Tampoco se ha purificado la proteína nativa, y no se ha proporcionado ninguna sugerencia en cuanto a cómo se podría completar la clonación de Can f 4.

En un resumen de Saarelainen et al. publicado en Abstract Book of 3rd International Symposium on Molecular Allegology en Salzburgo, de 18 a 20 de Abril de 2008, se establece que un mAb específico de Can f 4 reconocía una proteína de 20 kDa en un extracto de caspa de vaca.

En una edición especial de la revista científica Allergy que publica los resúmenes del XXVIII Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology (EAACI) en Varsovia de 6 a 10 de Junio de 2009, existe un resumen que describe que se ha clonado un ADNc que codifica Can f 4 completo [Allergy 64 (Supl. 90) : 179-538) . Sin embargo no se indica sobre cómo se podría lograr esta clonación y no se proporciona ninguna secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos.

El registro de la base de datos de NCBI Protein XP_581277, introducido el 30 de Septiembre 2005, contiene una proteína de tipo proteína de unión a odorante pronosticada de 172 aminoácidos. La secuencia se proporciona en esta solicitud como SEQ ID NO: 4.

Compendio de la invención Los autores de la presente invención han identificado la necesidad en la técnica de una caracterización y validación adicionales de la trascendencia del alérgeno Can f 4.

Como se ha establecido anteriormente, un inmunoanálisis de laboratorio para la IgE específica puede detectar la mayoría de los casos de sensibilización a perros utilizando extracto natural caspa de perro, debido a las condiciones de análisis favorables y a una gran fase sólida disponible para el anclaje del alérgeno. Sin embargo, en un inmunoanálisis miniaturizado o no de laboratorio, tal como una micromatriz de alérgeno o una prueba de consultorio médico, se ha encontrado que la combinación de condiciones de análisis menos favorables, menor capacidad de unión al anticuerpo del reactivo alérgeno y un extracto de alérgeno natural de potencia limitada, causan una sensibilidad insuficiente del diagnóstico. Una situación similar puede existir también para inmunoanálisis para IgE específica para otros epitelios de animales. De este modo, existe la necesidad en algunos casos de utilizar proteínas alergénicas puras para conseguir suficiente sensibilidad en los ensayos de diagnóstico para IgE específica. Otra necesidad para el uso de componentes de alérgenos recombinantes está dada por el concepto de diagnóstico resuelto por componentes [24]. De acuerdo con este concepto, el análisis de la respuesta de IgE a componentes de alérgenos individuales en lugar de extractos de alérgenos completos permite una mejor distinción entre las sensibilizaciones cruzadas de los alérgenos y las sensibilizaciones originales los alérgenos. De este modo, existe la necesidad de identificar y producir como proteína recombinante todos los componentes potenciales de alérgenos a partir de una fuente de alérgeno concreta.

Los presentes autores de la presente invención experimentaron problemas cuando trataron de secuenciar y clonar Can f 4 mediante el uso de métodos convencionales conocidos en la técnica. Los problemas solo se resolvieron mediante el uso de métodos no convencionales, como se describe a continuación en la sección Resultados. La presente invención se basa en el hallazgo inesperado de la unión del anticuerpo IgE a extracto de caspa tanto de perro como de vaca, y la comprensión de que a fin de identificar la secuencia de ácido nucleico y para completar la clonación de Can f 4, los autores de la presente invención tuvieron que correlacionar Can f 4 con una proteína de otro organismo.

En un aspecto, la invención se refiere a un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica dicho alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante.

En otros aspectos, la invención se refiere a un vector que comprende dicho ácido nucleico, y a una célula anfitriona que comprende dicho vector.

En otro aspecto más, la invención se refiere al uso de un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante en un diagnóstico in vitro de alergia de tipo I.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para producir una composición de alérgeno, que comprende la etapa de añadir un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante a una composición que comprende un extracto de alérgeno y/o al menos un componente de alérgeno purificado.

En otro aspecto más, la invención se refiere a un método de diagnóstico in vitro para diagnosticar una alergia de tipo I en un paciente, en donde una muestra de fluido corporal tal como una muestra de sangre o suero del paciente se pone en contacto con un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante, y se detecta si la muestra del paciente contiene o no anticuerpos IgE que se unen específicamente al alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante, en donde la presencia de tales anticuerpos IgE que se unen específicamente... [Seguir leyendo]

1. Un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 2.

2. Una molécula de ácido nucleico que codifica el alérgeno Can f 4 de acuerdo con la reivindicación 1.

3. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, que tiene la secuencia de acuerdo con el SEQ ID NO: 1.

4. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 o 3.

5. Una célula anfitriona que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con los residuos de aminoácido 17-174 del SEQ ID NO: 2.

7. El uso del alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para los anticuerpos IgE con dicho alérgeno Can f 4, en un diagnóstico in vitro de alergia de tipo I.

8. Un método para el diagnóstico in vitro de alergia tipo I que comprende las etapas

-Poner en contacto una muestra de fluido corporal de un paciente que se sospecha que tiene alergia de tipo I con el alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para los anticuerpos IgE con el alérgeno Can f 4; y

-Detectar la presencia, en la muestra, de anticuerpos IgE que se unen específicamente a dicho alérgeno Can f 4, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para los anticuerpos IgE con el alérgeno Can f 4,

en donde la presencia de tales anticuerpos IgE que se unen específicamente a dicho alérgeno Can f 4, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para los anticuerpos IgE con el alérgeno Can f 4, es indicativa de una alergia de tipo I.

9. Un kit de diagnóstico para realizar el método de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende el alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para los anticuerpos IgE con el alérgeno Can f 4.

10. Un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para los anticuerpos IgE con el alérgeno Can f 4, para su uso en un método para el tratamiento de una alergia de tipo I a un mamífero, preferiblemente en donde el mamífero es canino.

11. El uso de un alérgeno Bos d 23k producido de manera recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 4, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para los anticuerpos IgE con el alérgeno Bos d 23k, en un diagnóstico in vitro de alergia de Tipo I.

12. Método para el diagnóstico in vitro de alergia de tipo I que comprende las etapas

-Poner en contacto una muestra de fluido corporal de un paciente que se sospecha que tiene alergia de tipo I con un alérgeno Bos d 23k producido de manera recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 4, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para los anticuerpos IgE con el alérgeno Bos d 23k ; y

-Detectar la presencia, en la muestra, de anticuerpos IgE que se unen específicamente a dicho alérgeno Bos d 23k, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para los anticuerpos IgE con el alérgeno Bos d 23k,

en donde la presencia de tales anticuerpos IgE que se unen específicamente a dicho alérgeno Bos d 23k, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para los anticuerpos IgE con el alérgeno Bos d 23k, es indicativa de una alergia de tipo I.

13. Un alérgeno Bos d 23k producido de manera recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 4, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para anticuerpos IgE con el alérgeno Can f 4, para su uso en un método para el tratamiento de una alergia de tipo I a un mamífero, preferiblemente en donde el mamífero es bovino.