Una molécula de ADN que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº: 1

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un alérgeno novedoso de polen de fleo (Phleum pratense), Ph l p11 y al uso del mismo como un reactivo y en un kit de diagnóstico así como para inmunoterapia. Antecedentes de la invención

Un distintivo de la alergia atópica es la formación de anticuerpos de IgE para proteínas presentes en el material biológico sensibilizante. Después del contacto con la fuente de alérgeno, estas proteínas actuarán entrecruzando los anticuerpos de IgE presentes sobre la superficie de mastocitos, provocando de este modo la liberación de mediadores de inflamación tales como histamina. Como resultado tiene lugar una reacción alérgica (1).

En el mundo industrializado, hasta el 10% de la población humana muestra sensibilización alérgica a polen de gramíneas, haciendo del mismo una de las fuentes más importantes de alérgenos aéreos (2). Se han realizado esfuerzos considerables para la caracterización de alérgenos de polen de una diversidad de especies de gramíneas usando procedimientos bioquímicos e inmunológicos. Por tanto, se han identificado varias proteínas de unión a IgE que muestran una estructura conservada y reactividad cruzada serológica entre especies. En base a estos criterios, tales alérgenos de polen de gramíneas relacionados inmunológicamente se han asignados a grupos indicados por números. Éstos incluyen alérgenos del grupo 1, grupo 2/3, grupo 4 y grupo 5, que están representados en el polen de la mayoría de las especies de gramíneas (3).

Hasta la fecha se han clonado seis alérgenos diferentes de polen de fleo (Phleum pratense): Phl p 1 (4, 5), Phl p 2 (6), Phl p 5 (7-9), Phl p 6 (10, 11), Phl p 7 (12), Phl p 12 (profilina) (13) y Phl p 13 (14). Estos alérgenos se han producido todos como proteínas recombinantes que, por diferentes ensayos de actividad in vitro e in vivo, han mostrado que comparten propiedades inmunológicas y alergénicas con sus equivalentes nativos.

Usando un panel de cuatro alérgenos recombinantes (rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5 y profilina) en procedimientos de ensayo serológicos y cutáneos se obtuvieron resultados positivos en el 95% de una gran población de individuos alérgicos a polen de gramíneas (15). La sensibilización a alérgenos tales como Phl p 7 (una proteína de unión a calcio, de dos manos EF) y Phl p 12 tiene lugar en una menor proporción de alérgicos al polen de gramíneas, pero comparten epítopes de IgE con proteínas homólogas presentes en el polen de árboles y malas hierbas y, por lo tanto, pueden provocar síntomas de tipo inmediato en individuos sensibilizados después del contacto con estas fuentes de alérgenos no relacionadas (12, 16, 17).

Rossi y colaboradores (35) han medido recientemente los niveles de IgE específicos para varios alérgenos recombinantes, entre otros, Phl p 11. Sin embargo, la propia molécula de rPhl p 11 no se describe de ningún modo y Rossi y col. no proporcionan información sobre cómo producir rPhl p 11 o cualquier incentivo para usar el mismo en una composición farmacéutica.

Se desvela un procedimiento in vitro para diagnosticar alergia al alérgeno de polen de fleo Phl p 1 en el documento WO 95/34578, en el que se pone en contacto una muestra de líquido corporal con un polipéptido que presenta antigenicidad frente al menos un epítope de Phl p 1 y se detecta un complejo que contiene anticuerpo y polipéptido.

El documento WO 99/34826 se refiere a un procedimiento para desensibilizar un paciente frente a un alérgeno polipeptídico que comprende administrar al paciente un péptido obtenido del alérgeno, en el que se puede demostrar restricción para una molécula de MHC de Clase II poseída por el paciente para el péptido y el péptido puede inducir una respuesta de fase tardía. Se sugieren varios alérgenos que se pueden usar como material de partida para encontrar péptidos útiles en el procedimiento de des-sensibilización, tales como Ph1 p 11 y Lol p 11. Sumario de la invención

La presente descripción se refiere a un alérgeno novedoso de polen de fleo (Phleum pratense), Phl p 11. Aunque la mayoría absoluta de alérgicos al polen de gramíneas produce anticuerpos de IgE que se unen a alérgenos de polen de gramíneas del grupo 1 y grupo 5 -Phl p 1 y Phl p 5 en el caso de polen de fleo, un subconjunto de los pacientes también fabrican anticuerpos de IgE para una diversidad de otros componentes proteicos, tales como profilina, Phl p 7 o Phl p 11. Se piensa que estos pacientes tienen una actividad inmunológica más expansiva en su enfermedad alérgica, poniéndolos en un mayor riesgo de desarrollar reactividad química a un número creciente de fuentes de alérgenos (tales como pólenes de malas hierbas y árboles, descamaciones de gatos y perros, ácaros, etc.).

La profilina y Phl p 7 presentan una gran reactividad cruzada (verduras, frutas y pólenes de malas hierbas y árboles) y no son indicativos específicamente de la sensibilización a las proteínas de polen de gramíneas. Las estructuras de unión a anticuerpo presentes en Phl p 11, por otro lado, parecen ser específicas para polen de gramíneas y, por lo tanto, se pueden considerar un marcador de sensibilización multivalente a esta fuente de alérgeno particular, es decir, un marcador de propensión global aumentada a producir anticuerpos de IgE para sustancias ambientales. Se puede usar Phl p 11 recombinante para identificar el subconjunto de pacientes que están sensibilizados a estructuras polipeptídicas de Phl p 11 y sus homólogos en polen de otras especies de gramíneas. Aproximadamente la mitad de todos los pacientes que muestran reactividad de IgE a esta proteína de polen según se dice tiene sus anticuerpos dirigidos a estructuras de glucano presentes en el alérgeno del grupo 11. Estas estructuras de glucano presentan reactividad cruzada en la naturaleza y los anticuerpos que se unen a los mismos pueden no ser informativos/diagnósticos en relación a la sensibilización específica de polen de gramíneas. La reactividad de IgE con rPhl p 11, por tanto, puede ser informativa con respecto al estado de diversificación inmunológica de la sensibilización alérgica de los pacientes al polen de gramíneas, independientemente de otras fuentes de alérgenos.

Como un reactivo de inmunoterapia definido, el Ph1 p 11 recombinante se puede usar para tratar específicamente pacientes sensibilizados provocando una respuesta inmune protectora o atenuante. La sustancia activa puede ser una proteína que comprende la secuencia polipeptídica natural (“tipo silvestre”) o un derivado con propiedades de seguridad o eficacia mejoradas.

Por tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere a moléculas de ADN que codifican el polipéptido con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº: 1 de la lista de secuencias adjunta y en aspectos adicionales al asunto como se define adicionalmente en las reivindicaciones.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un polipéptido de Phl p 11 que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº: 1 para la producción de un fármaco para inmunoterapia (“vacunación de alergia”) de pacientes alérgicos al polen de gramíneas que muestran reactividad del anticuerpo de IgE a Phl p 11. Preferentemente, el uso es para inmunoterapia (“vacunación de alergia”) de pacientes alérgicos al polen del fleo que muestran reactividad de anticuerpo de IgE a Phl p 11.

Descripción detallada de la invención

LEYENDAS DE LAS FIGURAS FIGURA 1. Identificación de Phl p 11 usando SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia de extracto de polen de P. pratense. A: Se redujo y separó extracto de polen por SDS-PAGE, seguido de tinción con Azul Brillante de Coomassie. La banda de proteína débil identificada como Phl p 11 se marca con una flecha. B: Análisis de inmunotransferencia de un gel duplicado, en el que se visualiza la unión de los anticuerpos de IgE en suero de un paciente. Carril 1: marcadores de peso molecular, carril 2: extracto de polen de P. pratense. FIGURA 2. Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos deducida de ADNc de Phl p 11. Una fase de lectura abierta idéntica a todos los clones se ajustó de forma estrecha a la preferencia de codón obtenida de todos los genes de P. pratense publicados expresados en polen. Las secuencias de nucleótidos subrayadas representan los cebadores GSP-1 y GSP-2. Las puntas de flecha abiertas indican las diferencias de nucleótidos entre los clones que se analizaron; los códigos de ambigüedad de nucleótidos convencionales se usan en esas posiciones....

1. Una molécula de ADN que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº: 1.

2. La molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de ácido nucleico de los nucleótidos 1-429 de la Figura 2 y que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1.

3. Un procedimiento para producir Ph1 p 11 recombinante, que comprende las etapas -expresar la molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 en un organismo

huésped; y -purificar el Phl p 11 recombinante producido.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el organismo huésped es un huésped procariota, preferentemente E. coli.

5. Uso de un polipéptido Ph1 p 11 que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº: 1 para la producción de un fármaco para inmunoterapia de pacientes alérgicos a polen de gramíneas que muestran reactividad de anticuerpo de IgE frente a Ph1 p 11.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5 para la producción de un fármaco para inmunoterapia de pacientes alérgicos a polen de fleo que muestran reactividad de anticuerpo de IgE frente a Ph1 p 11.

7. Un polipéptido Ph1 p 11 producido recombinantemente o sintetizado químicamente que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº: 1.