Virus del herpes simple (VHS) con tropismo modificado, utilizaciones y procedimiento de preparación del mismo.

Virus del herpes simple (VHS) modificado que comprende una envoltura glucoproteica en la que un anticuerpomonocatenario heterólogo sustituye una parte eliminada del dominio gD de dicha envoltura glucoproteica paraformar una proteína de fusión,

en el que

a) dicha parte eliminada comienza en una posición dentro de los aminoácidos 1 a 8 y acaba en una posicióndentro de los aminoácidos 38 a 55 de gD; o comienza en una posición dentro de los aminoácidos 40 a 61 yacaba en una posición dentro de los aminoácidos 210 a 218 de gD;

b) dicho anticuerpo monocatenario comprende un dominio ligero variable (VL) y un dominio pesado variable (VH)separados por un enlazador (L1), en el que el enlazador permite a VL y VH asumir la conformación apropiada demanera que el anticuerpo monocatenario pueda unir en condiciones específicas un receptor que se expresasobre las células tumorales pero no sustancialmente sobre las células no tumorales;

c) la envoltura se modifica de manera que la capacidad del VHS modificado de interactuar con el receptornectina1/HveC se reduce.

Virus del herpes simple (VHS) con tropismo modificado, utilizaciones y procedimiento de preparación del mismo Campo de la invención La presente invención se refiere a un virus de herpes simple modificado (VHS) , a las utilizaciones del VHS modificado, a una preparación farmacéutica y a un procedimiento de preparación de un VHS modificado.

Antecedentes Una nueva frontera en el tratamiento de tumores es la viroterapia oncolítica, por la que un virus competente en replicación infecta las células tumorales, se propaga de célula a célula del tumor y las destruye. Dos de dichos tumores son los cánceres de mama y de ovario, que afectan a los animales tales como los seres humanos. Alrededor del 30% de los tumores de mama humanos, así como algunos tumores de ovario, son muy malignos y metastásicos.

Estos tumores deben su alto grado de malignidad y metastasicidad a la expresión de un receptor específico de moléculas de la superficie celular, denominado HER2, que pertenece a la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico, y generalmente se tratan con cirugía o cirugía y radioterapia combinadas o quimioterapia.

El VHS es un virus patógeno para las células de mamíferos [VHS-1 se describe, por ejemplo en Ejercito, P. M., et al. (1968) . J. Gen Virol. 2:357 y su genoma tiene el número de registro NC-001806 (GenBank) ].

El VHS se introduce en las células por un proceso de varias etapas. La primera etapa es la fijación a la superficie celular, mediada por la interacción de las glucoproteínas gB y gC (Laquerre S., Argnani R., Anderson D. B., Zucchini S., Manservigi R., Glorioso J. C. (1998) , J. Virol. 72 (7) : 6119-30) . Esto va seguido de la interacción más específica de la glucoproteína D (gD) de la envoltura del virión con uno de sus receptores de entrada: nectina1/ HveC, HVEM/HveA y restos sulfatados de sulfato de heparán enlazados por O (Spear P. G., Eisenberg R. J., Cohen G. H., (2000) Virology 275:1-9) (Campadelli-Fiume G., Cocchi F., Menotti L., López M. (2000) Reviews in Medical Virology, 10:305-319) (Campadelli-Fiume G. et al. (2007) Rev. Med. Virol., 17:313-326) (los códigos de GenBank para los receptores son los siguientes: nectina1 alfa AF060231, nectina1 beta AF110314, HVEM U70321) .

En los últimos años, se ha intentado utilizar VHS genéticamente modificados como agentes oncolíticos principalmente para el tratamiento del glioma maligno. Dado que los virus naturales son virulentos, atacan y destruyen muchas células y tejidos diferentes, los VHS oncolíticos experimentales se han atenuado mucho. Los virus que han alcanzado los ensayos clínicos se hicieron dependientes para su replicación en la célula tumoral en división mediante la eliminación de dos genes de VHS, es decir, el gen gamma 43.5 - que codifica la proteína ICP34.5 cuya función es impedir la interrupción de la síntesis de proteínas en las células infectadas, y el gen UL39 que codifica la subunidad grande de la ribonucleótido reductasa. Estos virus están dañados por la baja capacidad de replicarse, incluso en células en división, una característica que da lugar a dos efectos negativos. En primer lugar, la administración de dichos virus a los tumores no produce un alto rendimiento de la descendencia de los virus, capaces de propagarse de célula a célula del propio tumor, y por lo tanto ampliar la respuesta a cualquier dosis terapéutica dada del virus. En segundo lugar, los virus son difíciles de cultivar y apenas se pueden producir a gran escala (10 -10 unidades formadoras de placas UFP/ml) para producir la cantidad de virus requerida para aplicaciones clínicas. Por otra parte, la capacidad conservada del virus para unirse a cualquier célula que lleva uno de los receptores naturales para el VHS sustrae el virus a los tejidos tumorales que más lo necesitan y disminuye el efecto terapéutico de la destrucción de células tumorales, y puede ejercer la infección no deseada de tejidos y células no cancerosos, incluyendo su muerte por apoptosis. Se señala que, incluso si estos virus se redirigían a los receptores específicos de tumores – están no obstante muy atenuados.

Recientemente VHS redirigidos a receptores específicos se han modificado genéticamente para que puedan infectar células que necesitan ser destruidas mientras se mantiene una alta capacidad de replicarse y propagarse de célula a célula. Aunque dichos virus tienen una buena capacidad de propagarse entre las células tumorales, todavía infectan indeseablemente tejidos y células no cancerosas.

La solicitud de patente con número de publicación WO2004/033639, da a conocer un VHS recombinante, que expresa en su envoltura glucoproteica una citocina natural. Aunque la utilización de VHS recombinante de este tipo ha sido propuesta para el tratamiento de tumores, es importante hacer hincapié en que: el receptor diana tiene el ligando natural de pequeño tamaño tal que puede insertarse fácilmente en gD, y el VHS recombinante propuesto es todavía capaz de interactuar con los receptores nectina1/HVEC y HVEM/HveA. En particular, el documento WO2004/033639 no consigue identificar mutaciones que podrían resultar en un VHS recombinante que ya no es capaz de unir nectina1/HveC y es capaz de unir receptores (tales como HER2/ErbB2) de células enfermas. Zhou, G. et al. (2003) J. Virol. Vol. 77, nº: 6, páginas 3759-3767 da a conocer una serie de mutantes de inserción-supresión de gD para cartografiar los dominios de gD necesarios para bloquear la apoptosis por los virus gD-1- y gD-1+ y los implicados en la fusión célula a célula, demostrando que las modificaciones, especialmente las supresiones en la parte terminal en N de gD, afectan la unión a la nectina-1.

De ello se deduce que existe una necesidad todavía en la técnica de agentes terapéuticos víricos dirigidos selectivamente a células que necesitan ser destruidas. En particular, existe una necesidad de agentes terapéuticos víricos dirigidos a receptores que no tienen ningún ligando natural, y se sobreexpresan o se expresan selectivamente en las células enfermas, tales como las células cancerosas.

Sumario Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un VHS modificado, como se define en las reivindicaciones, diseñado para eliminar al menos en parte, los inconvenientes de la técnica conocida, y que, al mismo tiempo, son fáciles de aplicar.

Otros objetivos de la presente invención consisten en proporcionar utilizaciones del VHS modificado, según las reivindicaciones, preparados farmacéuticas, y un procedimiento de preparación del VHS modificado.

A menos que se especifique explícitamente lo contrario, los siguientes términos tienen el significado que a continuación se indica.

Como se emplea en la presente memoria, "anticuerpo monocatenario" (scFv) se refiere al anticuerpo monocatenario "apropiadamente denominado" (es decir, que tiene dos dominios conectados por un enlazador) u otros derivados de anticuerpos similares (por ejemplo, dominios individuales de tipo V) . Ventajosamente, los "anticuerpos monocatenarios" se "denominan apropiadamente" anticuerpos monocatenarios. Un ejemplo no limitativo de un anticuerpo monocatenario "apropiadamente denominado" es scHER2 (descrito en los ejemplos presentados a continuación) .

Como se emplea en la presente memoria, "porcentaje de identidad" o "% de identidad" entre dos secuencias de aminoácidos o de nucleótidos se refiere al porcentaje de restos de aminoácidos o nucleótidos idénticos en las posiciones correspondientes en las dos secuencias alineadas de manera óptima.

Para establecer el "porcentaje de identidad" de las dos secuencias de aminoácidos o de nucleótidos se alinean las secuencias; para tener una alineación óptima, son posibles espacios (supresiones o inserciones - que posiblemente pueden estar situadas en los extremos de las secuencias) . Se comparan los restos de aminoácidos o de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que ocupa la posición correspondiente en la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en esa posición. El "porcentaje de identidad" entre dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias [es decir, % de identidad = (número de posiciones idénticas / número de posiciones totales x 100].

De acuerdo con las formas de realización ventajosas, las secuencias tienen la misma longitud (mismo número de restos de aminoácidos o nucleótidos) .

Favorablemente, las secuencias comparadas no tienen espacios. El porcentaje de identidad se puede obtener empleando algoritmos matemáticos. Un ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático, que se emplea para comparar dos secuencias es... [Seguir leyendo]

1. Virus del herpes simple (VHS) modificado que comprende una envoltura glucoproteica en la que un anticuerpo monocatenario heterólogo sustituye una parte eliminada del dominio gD de dicha envoltura glucoproteica para formar una proteína de fusión, en el que a) dicha parte eliminada comienza en una posición dentro de los aminoácidos 1 a 8 y acaba en una posición dentro de los aminoácidos 38 a 55 de gD; o comienza en una posición dentro de los aminoácidos 40 a 61 y acaba en una posición dentro de los aminoácidos 210 a 218 de gD;

b) dicho anticuerpo monocatenario comprende un dominio ligero variable (VL) y un dominio pesado variable (VH) separados por un enlazador (L1) , en el que el enlazador permite a VL y VH asumir la conformación apropiada de manera que el anticuerpo monocatenario pueda unir en condiciones específicas un receptor que se expresa sobre las células tumorales pero no sustancialmente sobre las células no tumorales;

c) la envoltura se modifica de manera que la capacidad del VHS modificado de interactuar con el receptor nectina1/HveC se reduce.

2. VHS modificado según la reivindicación 1, en el que la envoltura está modificada de manera que la capacidad del VHS modificado para interactuar con el receptor nectina1/HveC y HVEM/HveA se reduce o se elimina sustancialmente.

3. VHS modificado según la reivindicación 1 o 2, en el que la parte eliminada de gD empieza en la posición 6 y acaba en la posición 38, o empieza en la posición 61 y acaba en la posición 218.

4. VHS modificado según una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho gD tiene por lo menos 80% de identidad con SEC. ID. nº: 1.

5. VHS modificado según una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho receptor expresado sobre las células tumorales tiene por lo menos 90% de identidad con un receptor seleccionado de entre: HER2/ErbB2, EGFR1, EGFR3, PMSA, CEA, GD2, VEGFR1 y VEGFR2.

6. VHS modificado según una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo monocatenario comprende además un segundo enlazador (L2) y/o un tercer enlazador (L3) , en el que:

VH está situado entre y conecta L1 y L2, y

HL está situado entre y conecta L1 y L3.

7. VHS modificado según una de las reivindicaciones 6 a 8, en el que:

VL tiene por lo menos 80% de identidad con la SEC. ID. nº: 2

VH tiene por lo menos 80% de identidad con la SEC. ID. nº: 3

L1 tiene por lo menos 50% de identidad con la SEC. ID. nº: 4

L2 tiene por lo menos 50% de identidad con la SEC. ID. nº: 5

L3 tiene por lo menos 50% de identidad con la SEC. ID. nº: 6 o con la SEC. ID. nº: 7

8. VHS modificado según una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha proteína de fusión resultante de la sustitución de una parte de gD con dicho ligando peptídico tiene por lo menos 70% de identidad con la SEC. ID. nº: 9 o la SEC. ID. nº: 10.

9. VHS modificado según una de las reivindicaciones anteriores que comprende además un marcador, y en particular un marcador adecuado para visualizar un tumor de ovario, un tumor de mama, un tumor de próstata, un tumor de colon, un tumor de estómago, un tumor de glándulas salivales, un melanoma, un carcinoma de cabeza y cuello, un tejido neoangiogénico de un tumor, neuroblastoma y/o metástasis de los mismos.

10. Preparación farmacéutica que comprende un VHS modificado según una de las reivindicaciones 1 a 9 anteriores y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. VHS modificado según una de las reivindicaciones 1 a 9 anteriores para su utilización en el tratamiento de una enfermedad tumoral, y en particular de un tumor de ovario, un tumor de mama, un tumor de próstata, un tumor de colon, un tumor de estómago, un tumor de glándulas salivales, un melanoma, un carcinoma de cabeza y cuello o un

neuroblastoma.

12. VHS modificado según una de las reivindicaciones 1 a 9 anteriores para su utilización en el tratamiento de una

metástasis de una enfermedad tumoral, y en particular de una metástasis de un tumor de ovario, un tumor de mama, 5 un tumor de próstata, un tumor de colon, un melanoma o de un neuroblastoma.

13. Procedimiento para preparar un VHS modificado según una de las reivindicaciones 1 a 9 anteriores, que comprende:

eliminar una parte del ADN que codifica el gD del VSH, sustituir la parte eliminada con el ADN que codifica el anticuerpo monocatenario que determina la capacidad del VHS modificado resultante para unirse a por lo menos un receptor expresado por las células tumorales pero no sustancialmente por las células no tumorales.