Construcciones de ácidos nucleicos.

Una construcción de ácido nucleico que comprende:

(i) una secuencia promotora quimérica que comprende:

(a) una secuencia promotora temprana inmediata de hCMV;

(b) el exón 1 y 5 al menos una parte del exón 2 del gen temprano inmediato principal de hCMV, siendo dicho exón 1 y al menos una parte del exón 2 contiguos; y

(c) un intrón heterólogo que reemplaza completa o parcialmente el intrón A nativo del gen temprano inmediato principal de hCMV;

(ii) una secuencia codificante unida operativamente con la secuencia promotora (i) y;

(iii) una secuencia potenciadora 3' de, y unida operativamente con, la secuencia codificante (ii);

en la que la secuencia potenciadora deriva de una 3'UTR de una secuencia de HBsAg, y la secuencia codificante (ii) es heteróloga de la secuencia potenciadora.

Construcciones de ácidos nucleicos Campo de la invención La invención se refiere a los campos de la biología molecular en la inmunología y, en general, a reactivos útiles en técnicas de inmunización de ácidos nucleicos. Más específicamente, la invención se refiere a construcciones de ácidos nucleicos para la expresión de polipéptidos antigénicos, y a estrategias de inmunización de ácidos nucleicos usando dichos reactivos.

Antecedentes de la invención La terapia génica y la inmunización de ácidos nucleicos son enfoques prometedores para el tratamiento y prevención de enfermedad tanto adquirida como heredada. Estas técnicas permiten la transferencia de un ácido nucleico deseado a un sujeto con expresión in vivo posterior. La transferencia puede conseguirse transfectando las células o los tejidos del sujeto ex vivo y volviendo a introducir el material transformado en el huésped. Como alternativa, el ácido nucleico puede administrarse in vivo directamente al receptor.

Cada una de estas técnicas requiere expresión eficaz del ácido nucleico en la célula transfectada, para proporcionar una cantidad suficiente del producto génico terapéutico o antigénico. Se conocen varios factores que afectan a los niveles de expresión obtenidos, incluyendo eficacia de transfección, y la eficacia con la que el gen o secuencia de interés se transcribe y se traduce el ARNm.

Se han descrito un número de sistemas de expresión en la técnica, cada uno de los cuales típicamente consiste en un vector que contiene un gen o secuencia de nucleótidos de interés unido operativamente con secuencias de control de la expresión. Estas secuencias de control incluyen secuencias promotoras de la transcripción y secuencias de inicio y terminación de la transcripción. Los promotores habitualmente usados para sistemas de expresión de células de mamífero incluyen el promotor temprano de SV40, un promotor de citomegalovirus (CMV) tal como el promotor temprano inmediato de CMV (Chapman y col (1991) Nucl. Acids Res. 19:3979-3986) , el promotor de repetición terminal larga (LTR) de virus de tumor mamario de ratón, el promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP) y el promotor de virus del herpes simple (VHS) , entre otros. También se usan habitualmente promotores no virales, tales como un promotor derivado del gen de metalotioneína murina.

Los sistemas de expresión con frecuencia incluyen elementos moduladores de la transcripción, denominados “potenciadores”. Los potenciadores se definen en general como un agente de acción en cis, que cuando está unido operativamente con una secuencia génica/promotora, aumentará la transcripción de esa secuencia génica. Los potenciadores pueden actuar desde posiciones que están mucho más lejos de una secuencia de interés que otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, promotores) ; y pueden actuar cuando se sitúan en cualquiera de las orientaciones relativas a la secuencia de interés (Banerji y col. (1981) Cell 27:299-308, de Villeirs y col. (1981) Nucl. Acids Res. 9: 6251-6264) . Se han identificado potenciadores de varias fuentes virales incluyendo virus del polioma, virus BK, citomegalovirus (CMV) , adenovirus, virus de simio 40 (SV40) , virus del sarcoma de Moloney, virus del papiloma bovino y virus del sarcoma de Rous (de Villeirs y col mencionado anteriormente, Rosenthal y col. (1983) , Science 222:749-755, Hearing y col. (1983) Cell 33:695-703, Weeks y col. (1983) Mol. Cell. Biol. 3:12221234, Levinson y col. (1982) Nature 295: 568-572, y Luciw y col. (1983) Cell 33: 705-716) .

Un nnúmero de sistemas de expresión para inmunización de ácidos nucleicos y terapia génica usan el promotor temprano inmediato de hCMV. Véase, por ejemplo las Patentes de Estados Unidos N º 5.168.062 y 5.385.839 de Stinski, y la memoria descriptiva de la Patente EP 0323997 B1. Los vectores de expresión que usan el promotor temprano inmediato del hCMV incluyen, por ejemplo, pWRG7128 (Roy y col, Vaccine 19, 764-778, 2001) , y pBC12/CMV y pJW4303 que se mencionan en el documento WO 95/20660. Chapman y col (1991) presentan niveles reducidos de expresión del promotor temprano inmediato del hCMV en ausencia el intrón A de hCMV. Los documentos WO 0231137 y WO 03011334 describen construcciones de ácido nucleico adecuadas para su uso en inmunización de ácidos nucleicos.

Sumario de la invención Se ha desarrollado una construcción de ácido nucleico usando secuencias de expresión/promotoras virales manipuladas, que proporcionan expresión potenciada de secuencias codificantes heterólogas en células hospedadoras. La construcción es adecuada para expresión eficaz de genes que codifican antígenos, y pueden usarse por lo tanto en inmunización de ácidos nucleicos. En particular, la construcción puede proporcionarse en partículas vehículo, para su uso en inmunización de ácidos nucleicos mediada por partículas.

En consecuencia, la presente invención proporciona:

1. Una construcción de ácido nucleico que comprende:

(i) una secuencia promotora quimérica que comprende:

(a) una secuencia promotora temprana inmediata de hCMV;

(b) el exón 1 y al menos una parte del exón 2 del gen temprano inmediato principal de hCMV, siendo dicho exón 1 y al menos una parte del exón 2 contiguos; y

(c) un intrón heterólogo que reemplaza completa o parcialmente el intrón A nativo del gen temprano inmediato principal de hCMV;

(ii) una secuencia codificante unida operativamente con la secuencia promotora (i) y;

(iii) una secuencia potenciadora 3' de y unida operativamente con la secuencia codificante (ii) ; en la que la secuencia potenciadora deriva de una 3'UTR de una secuencia HBsAg, y la secuencia codificante (ii) es heteróloga de la secuencia potenciadora.

2. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con el punto 1 que comprende además una secuencia líder no traducida derivada de la secuencia de antígeno preS2 de VHB, secuencia de antígeno e de VHB y secuencia de antígeno gD de VHS de tipo 2, en la que la secuencia líder está unida operativamente con el promotor y la secuencia codificante, y la secuencia codificante es heteróloga de la secuencia líder no traducida.

3. Una construcción de ácido nucleico que comprende:

(i) una secuencia promotora quimérica que comprende:

(a) una secuencia promotora temprana inmediata de hCMV;

(b) el exón 1 y al menos una parte del exón 2 del gen temprano inmediato principal de hCMV, siendo dicho exón 1 y al menos una parte del exón 2 contiguos; y

(c) un intrón heterólogo que reemplaza completa o parcialmente el intrón A nativo del gen temprano inmediato principal de hCMV;

(ii) una secuencia codificante en unión operativa con el promotor quimérico;

(iii) una secuencia líder no traducida que se selecciona de la secuencia del antígeno preS2 de VHB, secuencia de antígeno e de HBV y secuencia de antígeno de VHS de tipo 2gD y que está en unión operativa con el promotor quimérico; y

(iv) una secuencia potenciadora que deriva de una región no traducida 3' (UTR) de una secuencia de HBsAg, que está en unión operativa con el promotor quimérico y que está corriente abajo de la secuencia codificante.

4. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con uno cualquiera de los puntos precedentes en la que:

(i) la secuencia promotora temprana inmediata de hCMV (a) comprende SEC ID Nº 1, una variante funcional de la misma con al menos 80 % de identidad o un fragmento funcional de una de las dos; y/o

(ii) la secuencia del exón (b) comprende SEC ID Nº 2, una variante funcional de la misma con al menos 80 % de identidad o un fragmento funcional de una de las dos.

5. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con uno cualquiera de los puntos precedentes en la que el intrón heterólogo (c) comprende una secuencia seleccionada de la secuencia del intrón A del gen de insulina de rata, la secuencia del intrón A del gen de queratina de pollo, la secuencia del intrón A del gen de actina cardiaca de pollo, una variante funcional con al menos 80 % de identidad con una secuencia de dicho intrón A y un fragmento funcional de una secuencia de dicho intrón A o de dicha variante funcional de los mismos.

6. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con el punto 5 en la que la secuencia del intrón A del gen de insulina de rata comprende SEC ID Nº 3, una variante funcional de la misma con al menos 80 % de identidad, o un fragmento funcional de una de las dos.

7. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con uno cualquiera de los puntos precedentes, en la que:

(i) la secuencia líder no traducida se selecciona de SEC ID Nº... [Seguir leyendo]

1. Una construcción de ácido nucleico que comprende:

(i) una secuencia promotora quimérica que comprende:

(a) una secuencia promotora temprana inmediata de hCMV;

(b) el exón 1 y al menos una parte del exón 2 del gen temprano inmediato principal de hCMV, siendo dicho exón 1 y al menos una parte del exón 2 contiguos; y

(c) un intrón heterólogo que reemplaza completa o parcialmente el intrón A nativo del gen temprano inmediato principal de hCMV;

(ii) una secuencia codificante unida operativamente con la secuencia promotora (i) y;

(iii) una secuencia potenciadora 3' de, y unida operativamente con, la secuencia codificante (ii) ; en la que la secuencia potenciadora deriva de una 3'UTR de una secuencia de HBsAg, y la secuencia codificante (ii) es heteróloga de la secuencia potenciadora.

2. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende además una secuencia líder no traducida derivada de la secuencia del antígeno preS2 de VHB, secuencia del antígeno e de VHB y secuencia del antígeno de VHS de tipo 2gD, en la que la secuencia líder está unida operativamente con el promotor y la secuencia codificante y la secuencia codificante es heteróloga de la secuencia líder no traducida.

3. Una construcción de ácido nucleico que comprende:

(i) una secuencia promotora quimérica que comprende:

(a) una secuencia promotora temprana inmediata de hCMV;

(b) el exón 1 y al menos una parte del exón 2 del gen temprano inmediato principal de hCMV, siendo dicho exón 1 y al menos una parte del exón 2 contiguos; y

(c) un intrón heterólogo que reemplaza completa o parcialmente el intrón A nativo del gen temprano inmediato principal de hCMV,

(ii) una secuencia codificante en unión operativa con el promotor quimérico;

(iii) una secuencia líder no traducida que se selecciona de la secuencia del antígeno preS2 de VHB, secuencia del antígeno e de VHB y secuencia del antígeno de VHS de tipo 2gD y que está en unión operativa con el promotor quimérico; y

(iv) una secuencia potenciadora que deriva de una región no traducida 3' (UTR) de una secuencia de HBsAg, que está en unión operativa con el promotor quimérico y que está cadena abajo de la secuencia codificante.

4. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que:

(i) la secuencia promotora temprana inmediata de hCMV (a) comprende SEC ID Nº 1, una variante funcional de la misma con al menos 80 % de identidad o un fragmento funcional de una de ellas; y/o

(ii) la secuencia de exón (b) comprende SEC ID Nº 2, una variante funcional de la misma con al menos 80 % de identidad o un fragmento funcional de una de ellas.

5. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que el intrón heterólogo (c) comprende una secuencia seleccionada de la secuencia del intrón A del gen de insulina de rata, secuencia del intrón A del gen de queratina de pollo, secuencia del intrón A del gen de actina cardiaca de pollo, una variante funcional con al menos 80 % de identidad con una secuencia de dicho intrón A y un fragmento funcional de una secuencia de dicho intrón A o de dicha variante funcional de las mismas.

6. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5 en la que la secuencia del intrón A del gen de insulina de rata comprende SEC ID Nº 3, una variante funcional de la misma con al menos 80 % de identidad, o un fragmento funcional de una de ellas.

7. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que:

(i) la secuencia líder no traducida se selecciona de SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7, una variante funcional con al menos 80 % de identidad con una cualquiera de SEC ID Nº 5a7ºun fragmento funcional de una cualquiera de SEC ID Nº 5 a 7 o de dicha variante de las mismas; y/o

(ii) la secuencia potenciadora se selecciona de SEC ID Nº 8, una variante funcional con al menos 80 % de identidad con SEC ID Nº 8 o un fragmento funcional de SEC ID Nº 8 o de dicha variante de las mismas.

8. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende:

(i) una secuencia de poliadenilación, y/o

(ii) una secuencia que codifica un péptido señal.

9. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8, en la que:

(i) la secuencia de poliadenilación es una secuencia de poliadenilación de un gen seleccionado del gen de !globina de conejo, gen temprano o tardío del virus del papiloma humano (VPH) , el gen VSH-2gB, un gen temprano inmediato de CMV de simio y gen tardío de VHSgD, una variante funcional con al menos 80 % de identidad con una cualquiera de dichas secuencias o un fragmento funcional de una cualquiera de dichas secuencias de poliadenilación o dichas variantes funcionales de las mismas; y/o

(ii) el péptido señal se selecciona del péptido señal activador del plasminógeno tisular humano (hTPAsp) , péptido señal de aprotinina, péptido señal de extensina del tabaco, péptido señal de lisozima de pollo, una variante funcional con al menos 80 % de identidad con una cualquiera de dichas secuencias o un fragmento funcional de cualquiera de dicha secuencias que codifica el péptido señal o dicha variante funcional de las mismas.

10. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9 en la que la secuencia de poliadenilación se selecciona de SEC ID Nº 10, SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 13, una variante funcional con al menos 80 % de identidad con una cualquiera de SEC ID Nº 10 a 13 o un fragmento funcional de una cualquiera de SEC ID Nº 10 a 13 o de dicha variante de las mismas.

11. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que la secuencia codificante codifica un antígeno.

12. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11 en la que el antígeno es un antígeno de un patógeno viral, bacteriano, parasitario o fúngico, un antígeno de alergia o un antígeno de cáncer.

13. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 12 en la que el antígeno viral es un antígeno de VPH, VIH, VHS1, VHS2, virus de la gripe, virus de hepatitis A o virus de hepatitis B.

14. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 13 en la que el antígeno es HBsAg.

15. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la secuencia codificante codifica una subunidad A y/o subunidad B bacteriana que ribosila ADP, un homólogo activo de una o ambos de dichas subunidades en el que cada homólogo tiene al menos 80 % de identidad con dicha subunidad respectiva o un fragmento activo de dicha subunidad o de dicho homólogo activo de los mismos.

16. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 15, en la que la subunidad bacteriana se selecciona de la subunidad A de la toxina del cólera, subunidad B de la toxina del cólera, subunidad A de la toxina lábil por calor de E. coli, subunidad B de la toxina lábil por calor de E. coli, un homólogo activo que tiene al menos 80 % de homología con una cualquiera de dichas subunidades o un fragmento activo de una cualquiera de dichas subunidades o dichos homólogos activos.

17. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es un plásmido de ADN.

18. Partículas revestidas, adecuadas para suministro desde un dispositivo de suministro mediado por partículas, comprendiendo dichas partículas, partículas vehículo revestidas con una construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

19. Partículas revestidas de acuerdo con la reivindicación 18 en las que las partículas vehículo son oro o wolframio.

20. Un receptáculo de dosificación para un dispositivo de administración mediado por partículas que comprende partículas revestidas de acuerdo con la reivindicación 18 o 19.

21. Un dispositivo de administración mediado por partículas cargado con partículas revestidas de acuerdo con la reivindicación 18 o 19.

22. Un dispositivo de administración mediado por partículas de acuerdo con la reivindicación 21 que es una jeringa sin aguja.

23. Una preparación farmacéutica que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

24. Una vacuna que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.

25. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 24, que comprende además una construcción de adyuvante de acuerdo con la reivindicación 15 o 16.

26. Un procedimiento in vitro para obtener expresión en células de mamífero de un polipéptido de interés, comprendiendo dicho procedimiento transferir a dichas células una construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o partículas revestidas de acuerdo con la reivindicación 18 o 19.

27. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 para su uso en inmunización.

28. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 27, en el que la inmunización es contra infección por un patógeno, alergia o cáncer.

29. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 27 o 28 en la que el administración es para ser por inyección, administración de partículas transdérmicas, inhalación, por vía tópica, por vía oral, por vía intranasal o por vía transmucosa.