Vectores basados en anticuerpo anti-il-12, células huéspedes y métodos de producción y usos.

Un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NOs: 11-12.

Vectores basados en anticuerpo anti-il-12, células huéspedes y métodos de producción y usos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a vectores y plásmidos que dirigen expresiones de un anticuerpo, células huéspedes y métodos para hacer uso de los mismos, incluyendo secuencias potenciadoras y promotoras del vector específico y su interacción con los factores de transcripción de célula huésped.

Antecedentes Las moléculas de anticuerpo consisten en un una combinación de dos polipéptidos de cadena pesada (P) y dos de cadena ligera (L) . cada cadena pesada y ligeras comprende una región constante que contiene las regiones CL, CH1, región bisagra, CH2 y CH3, y una región variable que contiene las regiones hipervariables (regiones determinante del complemento (RDCs) ) ; las RDCs controlan las características de enlace de antígeno del anticuerpo. Las dos cadenas pesadas se unen y las cadenas ligeras en una estructura en forma de Y por medio de puentes disulfuros de tal manera que las regiones variables de las cadenas ligeras (V.sub L.) y cadenas pesadas (V.sub P.) están situadas unas junto a otras.

Para generar anticuerpos, se han usado técnicas convencionales de hibridoma en las que los clones de las células híbridas que expresan genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas de una molécula de anticuerpo se obtienen mediante inmunización con una molécula de anticuerpo. Esta técnica necesita la fusión de células de origen linfocítico, que contienen los genes para la formación de anticuerpos y células que forman líneas inmortales. Las células que tienen los genes en cuestión se obtienen generalmente mediante creación arbitraria de bibliotecas de células circulantes, y la filtración de los hibridomas con una reacción antígeno-anticuerpo después de que los clones del hibridoma se hayan multiplicado y cultivado. Esta técnica puede ser incierta y laboriosa con una producción limitada de anticuerpos, y se limita a aplicaciones para la producción de anticuerpos no humanos (por ejemplo, ratón) .

Además, los anticuerpos monoclonales y sus fragmentos pueden expresarse en varios sistemas huéspedes, tales como levadura E. coli, y células huéspedes de mamíferos. En general, un vector de expresión de mamífero contendrá (1) elementos reguladores, normalmente en forma de secuencias promotoras y potenciadoras virales y caracterizado por una amplio rango de huésped y tejido; (2) una secuencia “policlonaje”, que facilita la inserción de un fragmento de ADN en el vector plásmido; y (3) las secuencias responsables para el empalmen de intrón y la poliadenilación de transcripciones de ARN. Esta región continua del sitio promotor-policlonajepoliadenilación es referida comúnmente como la unidad de transcripición. El vector probablemente también tendrá

(4) un gen o genes marcadores seleccionables (por ejemplo, el gen beta-lactamasa) , que a menudo confieren resistencia a un antibiótico (tal como ampicilina) , que permite la selección de trasformadores positivos iniciales en E. coli; y (5) secuencias que facilitan la réplica del vector en huéspedes bacterianos y mamíferos.

A diferencia de la mayoría de los genes que se transcriben a partir de secuencias continuas genómicas de ADN, los genes de anticuerpo se montan a partir de segmentos de gen que pueden separarse comúnmente en la línea del germen. En particular, los genes de cadena pesada se forman mediante recombinación de tres segmentos genómicos que codifican las regiones variables (V) , de diversidad (D) y unión (U) /constante (C) del anticuerpo. Los genes de cadena ligera funcional se forman uniendo dos segmentos de gen; uno codifica la región V y el otro codifica la región U/C. Los locus de la cadena pesada y la cadena ligera .kappa. contienen muchos segmentos de gen V (los cálculos aproximados varían entre 100s y 1000s) estimados para abarcar más de 1000 kb. El locus .lambda. es, en cambio, mucho más pequeño y ha demostrado abarcar aproximadamente 300 kb en el cromosoma 16 en el ratón. Consiste en cuatro segmentos de gen de unión/constantes y dos segmentos de gen variables. La recombinación que da como resultado los genes funcionales ocurre predominantemente entre elementos V.sub.1 y U.sub.1/C.sub 1 o U.sub.3/C.sub.3 o entre elementos V.sub.2 y U.sub.2/C.sub.2 (U.sub.4 / C.sub.4 es un pseudogen) , aunque las recombinaciones entre V.sub.2 y U.sub.3/C.sub.3 o U.sub.1/C.sub.1 se ven muy raramente.

Un ejemplo de un vector de expresión de mamífero es CDM8. La unidad de transcripción de CDM8 está compuesta por un promotor quimérico (el promotor constitutivo AD169 de citomegalovirus humano fusionado con el promotor de polimerasa T7 ARN) , una región de policlonaje y el empalme de antígeno de tumor pequeño (t) SV40 y las señales de poliadenilación de región temprana derivadas de pSV2. El promotor de citomegalovirus humano (HCMV) se expresa en una variedad de tipos de células de mamíferos, mientras que el promotor de polimerasa de ARN dependiente de ADN bacteriófago T7 puede moverse a la transcripción/traslación in vitro libre de células de inserciones clonadas. Esta fusión promotora particular permite que los experimentos iniciales se realicen dentro de los confines del tipo de célula de mamífero huésped, mientras que el análisis y utilización adicional de la inserción clonada puede realizarse potencialmente en un sistema de transcripción/traslación in vitro libre de células. El promotor HCMV constitutivamente expresado también se ha utilizado en otros vectores de expresión mamífera además de CDM8. Los orígenes de réplica en CDM8 incluyen (1) .pi.VX (permitiendo, por ejemplo, réplica en E. coli)

(2) origen SV40 (por ejemplo, permitiendo la réplica en una variedad de tipos de célula COS) (3) origen de polioma (por ejemplo, permitiendo réplica en fibroblastos de ratón transformados por virus de polioma) y (4) el origen de bacteriófago M13 (por ejemplo, permitiendo la generación de plantilla de hebra sencilla para análisis de secuencia de ADN y/o mutagénesis de oligonucleótido dirigida al sitio) .

Además, CDM8 tiene el gen supF para la selección en E. coli. En este sistema de selección antibiótica, una construcción de plásmido basada en CDM8 se transforma a cepa E. coli especializada que contiene un episoma que transporta genes que codifican la resistencia a los antibióticas, ampicilina y tetracilina. Sin embargo, ambos genes contienen mutaciones de punto de terminación de cadena (codón “sin sentido”) que inactivan el fenotipo de resistencia. El producto de gen supF, un tARN supresor sin sentido, restaura el fenotipo resistente para cada antibiótico. Por lo tanto, la selección se basa en el crecimiento de la cepa E. coli que transporta el episomal especializado en el medio que contiene ampicilina y tetraciclina. Las colonias que muestran este fenotipo se transforman supuestamente con la construcción de plásmido basada en CDM8.

El vector CDM8 es compatible con líneas celulares COS así como líneas celulares transformadas con el virus polioma. Las líneas celulares COS son células CV1 de mono verde africano transformadas con un virus mutante SV40 defectuoso de origen. Las células COS producen el antígeno T grande, que se requiere en trans para promover la réplica de SV40 o construcciones de plásmido, tales como CDM8, que contienen las respectivas secuencias cis-actoras que inician la réplica viral. Por lo tanto, las células COS transfectadas con una construcción basada en CDM8 soportará la réplica del plásmido, dando como resultado un mayor número de copia de plásmido y un sobreexpresión temporal del gen de interés.

El principal uso de CDM8 es la clonación de expresión de cADN y la sobreproducción de proteínas específicas en un sistema de expresión in vitro de mamíferos. La clonación de expresión toma varias formas dependiendo del modo de detección utilizado para identificar el cADN de interés; sin embargo, la etapa inicial consiste en aislar mARN y sintetizar copias de ácido deoxirribonucleico de doble hebra de la población de mARN (cADNs) . Estos cADNs deber estar eficientemente ligados a un plásmido o vector de clonación de ADN bacteriófago y transferirse al huésped apropiado antes de la filtración y el análisis de la biblioteca. El vector CDM8 contiene dos sitios de restricción BstXI, haciéndolo tratable para el procedimiento del enlace “adaptador” de ligar cADNs al vector, es decir, el uso de fragmentos de ADN con extremo desafilado en un extremo (y por lo tanto compatibles con la ligadura con el cADN de extremo desafilado) pero que contienen un saliente no palindrómico (extremo engomado) en el otro extremo (por ejemplo, compatible con ligadura con vector de ADN digerido... [Seguir leyendo]

1. Un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NOs: 11-12.

2. Una célula huésped que comprende los vectores de expresión de acuerdo con la reivindicación 1.

3. La célula huésped de la reivindicación 2, donde la célula huésped es una célula huésped de mamífero.

4. La célula huésped de la reivindicación 3 donde la célula huésped es una célula huésped de mieloma murino.

5. Un kit que comprende el vector de la reivindicación 1.