Variantes del factor VII de coagulación humana.

Variante del polipéptido del factor VII de SEC ID nº: 1 comprendiendo una sustitución de la Met en la posición 298 conArg, Gln o Asn.

Variantes del factor VII de coagulación humana Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a nuevas variantes de factor de coagulación VIIa humano con actividad coagulante al igual que constructos de ácidos nucleicos que codifican tales variantes, vectores y células huésped que comprenden y expresan el ácido nucleico, composiciones farmacéuticas, usos y métodos de tratamiento.

Antecedentes de la invención [0002] La coagulación sanguínea es un proceso que consiste en una interacción compleja de varios componentes sanguíneos (o factores) que da lugar finalmente a un coágulo de fibrina. Generalmente, los componentes sanguíneos, que participan en lo que ha sido denominado como la "cascada" de coagulación, son proteínas enzimáticamente inactivas (proenzimas o zimógenos) que se convierten en enzimas proteolíticas por la acción de un activador (que por sí mismo es un factor de coagulación activado) . Los factores de coagulación que han experimentado tal conversión son generalmente denominados "factores activos", y se designan por la adición de la letra "a" al nombre del factor de coagulación (p. ej. Factor VIIa) .

La iniciación del proceso hemostático está mediada por la formación de un complejo entre el factor tisular, expuesto como resultado de la herida en la pared de vaso, y el factor VIIa. Este complejo luego convierte los factores IX y X en sus formas activas. El factor Xa convierte cantidades limitadas de protrombina a trombina en las células productoras de factor tisular. La trombina activa las plaquetas y los factores V y VIII en factores Va y VIIIa, ambos cofactores en el proceso adicional que conduce a la completa explosión de trombina. Este proceso incluye la generación de factor Xa por parte del factor IXa (en el complejo con el factor VIIIa) y ocurre en la superficie de las plaquetas activadas. La trombina convierte finalmente el fibrinógeno en fibrina dando como resultado la formación de un coágulo de fibrina. En los últimos años se ha encontrado que el factor VII y el factor tisular son los iniciadores principales de coagulación sanguínea.

El factor VII es una glicoproteína traza del plasma que circula en la sangre como un zimógeno monocatenario. El zimógeno es catalíticamente inactivo. El factor VII monocatenario se puede convertir en factor VIIa bicatenario por el factor Xa, factor XIIa, factor IXa, factor VIIa o trombina in vitro. Se cree que el factor Xa es el principal activador fisiológico del factor VII. Como otras diferentes proteínas plasmáticas implicadas en la hemostasis, el factor VII depende de la vitamina K por su actividad, que se requiere para la gamma-carboxilación de múltiples residuos de ácido glutámico que están reagrupados cerca del amino terminal de la proteína. Estos ácidos glutámicos gamma-carboxilados se requieren para la interacción inducida por iones metálicos del factor VII con fosfolípidos. La conversión de zimógeno factor VII en la molécula bicatenaria activada ocurre por escisión de un enlace peptídico interno Arg152 -Ile153. En presencia de factor tisular, los fosfolípidos e iones de calcio, el factor VIIa bicatenario activa de forma rápida el factor X o factor IX por proteólisis limitada.

Es frecuentemente deseable estimular o mejorar la cascada de coagulación en un sujeto. El factor VIIa ha sido usado para controlar trastornos de sangrado que tienen diferentes causas tales como deficiencias de los factores de coagulación (p. ej. hemofilia A y B o deficiencias de los factores de coagulación XI o VII) o inhibidores del factor de coagulación. El factor VIIa también ha sido usado para controlar un sangrado excesivo que ocurre en sujetos con una cascada de coagulación sanguínea en funcionamiento normal (sin deficiencias de factores de coagulación o inhibidores contra cualquiera de los factores de coagulación) . Tal sangrado puede, por ejemplo, estar provocado por una actividad defectuosa de las plaquetas, trombocitopenia o enfermedad de von Willebrand. El sangrado es también un problema importante en relación a la cirugía y otras formas de daño del tejido.

European Patent No. 200, 421 (ZymoGenetics) hace referencia a la secuencia de nucleótidos que codifica el factor VII humano y la expresión recombinante de factor VII en células mamíferas.

Dickinson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 14379-14384) hace referencia a la identificación de residuos de superficie que median en la unión del factor tisular y la actividad catalítica del factor VIIa. La mutagénesis de escaneado de alanina fue utilizada para establecer una lista extensiva de los 112 residuos que están implicados funcionalmente en la interacción del cofactor (es decir. factor tisular (TF) ) y la activación del factor X (FX) .

Iwanaga et al. (Thromb. Haemost. (supplement August 1999) , 466, abstract 1474) hace referencia a variantes de FVIIa donde los residuos 316-320 son eliminados o los residuos 311-322 se sustituyen por los residuos correspondientes de tripsina.

Existe, no obstante, todavía una necesidad de variantes del factor VIIa con actividad coagulante, variantes con alta actividad que puedan ser administradas en dosis relativamente bajas, y variantes que no produzcan efectos secundarios indeseables tales como la activación sistémica del sistema de coagulación y sangrado, respectivamente, asociado a terapias convencionales.

Descripción de la invención [0010] La invención proporciona polipéptidos del factor de coagulación VIIa con actividad coagulante, concretamente, variantes del polipéptido del factor VII de SEC ID nº: 1 comprendiendo una sustitución del Met en posición 298 con Arg, Gln o Asn. Los polipéptidos del factor VII de la invención pueden comprender además la sustitución de al menos uno de los aminoácidos en las posiciones restantes en el dominio de proteasa.

En otro aspecto, la invención se refiere a un constructo de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido del factor VII de la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante del factor VII.

En otro aspecto, la invención proporciona un vector recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos que codifica una variante de FVIIa.

En otro aspecto, la invención proporciona una célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos o el vector.

En otro aspecto, la invención proporciona un animal transgénico que contiene y expresa el constructo de ácidos nucleicos.

En otro aspecto, la invención proporciona una planta transgénica que contiene y expresa el constructo de ácidos nucleicos.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para producir el polipéptido del factor VII de la invención, el método que comprende el cultivo de una célula que comprende el constructo de ácidos nucleicos en un medio de crecimiento apropiado bajo condiciones que permiten la expresión del constructo de ácidos nucleicos y la recuperación del polipéptido resultante del medio de cultivo.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir la variante del factor VII de la invención, el método que comprende el cultivo de una célula que comprende el constructo de ácidos nucleicos en un medio de crecimiento apropiado bajo condiciones que permiten la expresión del constructo de ácidos nucleicos y la de recuperación del polipéptido resultante del medio de cultivo.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para producir el polipéptido del factor VII, el método que comprende la recuperación del polipéptido de la leche producida por el animal transgénico.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir la variante del factor VII, el método que comprende la recuperación de la variante de leche producida por el animal transgénico.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para producir el polipéptido del factor VII, el método que comprende el cultivo de una célula de una planta transgénica que comprende el constructo de ácidos nucleicos, y la recuperación del polipéptido de la planta resultante.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir la variante del factor VII, el método que comprende el cultivo de una célula de una planta transgénica que comprende el constructo de ácidos nucleicos, y la recuperación de la variante de la planta resultante.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una variante del polipéptido del factor VII de SEC ID nº: 1 que comprende una sustitución del Met en la posición 298 con Arg, Gln o Asn y, opcionalmente, una sustitución... [Seguir leyendo]

1. Variante del polipéptido del factor VII de SEC ID nº: 1 comprendiendo una sustitución de la Met en la posición 298 con Arg, Gln o Asn.

2. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 1, donde la Val en la posición 158 se sustituye con un aminoácido diferente.

3. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 2, donde dicha Val en la posición 158 se sustituye con Ser, Thr, Asn, Gln

o Glu; o donde la Met en la posición 298 se sustituye con Arg o Asn y la Val en la posición 158 se sustituye con Asp.

4. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, donde el Glu en la posición 296 se sustituye con un aminoácido diferente.

5. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 4, donde dicho Glu en la posición 296 se sustituye por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Arg, Lys y Val.

6. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la Lys en la posición 337 se sustituye con un aminoácido diferente.

7. Polipéptido del factor VII según la reivindicación 6, donde dicha Lys en la posición 337 se sustituye por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp y Glu.

8. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde al menos un aminoácido en las posiciones restantes en el dominio de proteasa se sustituye por un aminoácido diferente.

9. Polipéptido del factor VII según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que es V158D/E296V/M298Q-FVIIa.

10. Constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido del factor VII tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos definido en la reivindicación 10.

12. Animal transgénico no humano que contiene y expresa el constructo de ácidos nucleicos definido en la reivindicación 10.

13. Método para producir el polipéptido del factor VII definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-9, dicho método comprendiendo el cultivo de una célula, tal y como se define en la reivindicación 11, en un medio de crecimiento apropiado, bajo condiciones que permiten la expresión del constructo de ácidos nucleicos y la recuperación del polipéptido resultante del medio de cultivo.

14. Composición farmacéutica que comprende una variante del polipéptido del factor VII tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable.

15. Polipéptido del factor VII definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para el uso en el tratamiento de episodios hemorrágicos o para uso en la mejora del sistema hemostático normal.

FIGURA 1. La secuencia de aminoácidos para el factor VII de coagulación humano y nativo