VARIANTE ESTRUCTURAL DE LA HEMOGLOBINA.

Variante estructural de la hemoglobina.

La presente invención proporciona una nueva variante estructural de la hemoglobina,

de SEQ ID NO: 1, así como un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de hemoglobina glicosilada o HbA1c, y más concretamente de la diabetes mellitus, en un individuo que expresa esta variante de la hemoglobina. Dicho método comprende normalizar el valor obtenido para el nivel de expresión de la hemoglobina, preferiblemente de la HbA1c, en una muestra biológica aislada de un individuo en función del valor obtenido para el nivel de expresión de esta nueva variante estructural de la hemoglobina en esa misma muestra biológica.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201030893.

Solicitante: SERVICIO ANDALUZ DE SALUD.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: HERRERA DEL REY,María Teresa, DOMÍNGUEZ PASCUAL,Inmaculada, NARVÁEZ GARCÍA,Mª Carmen, INFANTE FONTÁN,Rocío, GUERRERO MONTÁLVEZ,Juan Miguel, VILLEGAS MARTÍNEZ,Ana, GONZÁLEZ FERNÁNDEZ,Fernando Ataulfo, ROPERO GRADILLA,Paloma.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/805 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Hemoglobinas; Mioglobinas.
  • G01N33/72 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › en los que intervienen pigmentos de la sangre, p. ej. la hemoglobina, la bilirrubina.

Fragmento de la descripción:

Variante estructural de la hemoglobina.

La presente invención se encuadra en el campo de la medicina, en concreto, dentro de las variantes estructurales de la hemoglobina que interfieren en los métodos de determinación de los niveles de hemoglobina glicosilada en una muestra biológica y por tanto, de los métodos de obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de hemoglobina glicosilada, concretamente de la diabetes mellitus.

Estado de la técnica anterior

La hemoglobina glicosilada o HbA1c es una hemoglobina en la cual la glucosa se une específicamente a la valina N-terminal de la cadena β de la hemoglobina, en un proceso no enzimático e irreversible. Esta hemoglobina es un marcador bioquímico empleado de manera rutinaria para la evaluación y control de individuos que presentan diabetes mellitus, ya que el valor obtenido tras su cuantificación se encuentra directamente relacionado con los niveles de glucemia del paciente de los últimos 3-4 meses, por lo que es de utilidad para la predicción de posibles complicaciones relacionadas con esta enfermedad, para el seguimiento del tratamiento del paciente e incluso para su diagnóstico. Sin embargo, la exactitud de los métodos de determinación del nivel de la HbA1c se puede ver afectada por la presencia de variantes de la hemoglobina en el paciente estudiado.

Así, en aquellos individuos que presentan algún tipo de hemoglobinopatía, las técnicas analíticas utilizadas para la cuantificación de la HbA1c suelen detectar, junto con ésta, las otras variantes de la hemoglobina (Hb) presentes en ellos cuyos valores alteran los resultados ofrecidos para la hemoglobina glicosilada. En el año 2000, se estimó que 12 millones de individuos con diabetes mellitus en todo el mundo presentaban también otras enfermedades asociadas a alteraciones en la hemoglobina.

Son muchas las variantes estructurales de la Hb que se han identificado hasta la fecha (Globin Gene Sever. HbVar: a database of human hemoglobin variants and thalassemias. http://globin.cse.psu.edu/cgi-bin/hbvar/counter) . Entre las más comunes se encuentran la HbF y las HbS, HbE, HbC y HbD, las cuales son codificadas por la sustitución de un solo aminoácido en la cadena β (Little R. R. and Roberts W. L, 2009, Journal of Diabetes Science and Technology, 3 (3) : 446-451) . Otros ejemplos de variantes de este tipo son la denominada Hb Baylor, codificada por la sustitución de una Leu por una Arg en el residuo 81 (EF5) de la β globina, o la Hb La Roche-sur-Yon, codificada por la sustitución de una Leu por una His en esa misma posición.

Las técnicas empleadas en la determinación de los valores de la HbA1c se han ido optimizado de manera que son capaces de detectar y corregir la interferencia que provocan los valores de estas otras variantes conocidas de la Hb con los valores obtenidos para la HbA1c, lo que permite, por tanto, obtener unos valores de esta última normalizados y útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de la diabetes mellitus. No obstante, el efecto que cada variante de la Hb produce sobre los resultados obtenidos en los métodos de determinación de la HbA1c varía en función del método empleado y de la variante de la Hb, de manera que los valores de cuantificación de la HbA1c resultantes pueden ser falsamente incrementados o disminuidos dependiendo de la técnica analítica empleada y del tipo de hemoglobinopatía presente en el paciente (Br y L. et al., 2001, Clinical Chemistr y , 47 (2) : 153-163) . De entre todos los métodos usados para medir los niveles de la HbA1c, los comúnmente empleados son cuatro, a saber, inmunoensayo, HPLC (de sus siglas en inglés High-Performance Liquid Chromatography) , afinidad de boronato y ensayos enzimáticos.

La identificación de nuevas variantes de la Hb es complicada, a no ser que éstas se manifiesten en una patología clínica, ya que la mayoría de ellas se deben a mutaciones que únicamente originan cambios en la estructura de la molécula que no conllevan manifestaciones fenotípicas. No obstante, las interferencias que las variantes de la Hb producen en los métodos de determinación de la HbA1c por HPLC pueden estudiarse en el cromatograma obtenido, por lo que es importante que los usuarios de estos métodos de medida sean capaces de identificarlas para valorar si el resultado ofrecido es o no aceptable. Así, mediante la observación de los resultados ofrecidos por los métodos de medida de la HbA1c, los expertos han identificado nuevas variantes de la Hb (Sacks D. B., 2003, Clinical Chemistr y , 49 (8) : 1245-1247) .

Sin embargo, existen variantes de la Hb aun desconocidas que interfieren en la exactitud de estos métodos, por lo que es necesaria su identificación para optimizar los métodos de obtención de datos útiles para determinar los valores de expresión de la HbA1c en los individuos que las expresan, con el fin de mejorar así los métodos de diagnóstico y/o seguimiento de la diabetes mellitus en estos pacientes.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona una nueva variante estructural de la hemoglobina, de SEQ ID NO: 1, de ahora en adelante "péptido de la invención", así como un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de hemoglobina glicosilada o HbA1c, y más concretamente de la diabetes mellitus, en un individuo que expresa el péptido de la invención. Dicho método comprende normalizar el valor obtenido para el nivel de expresión de la hemoglobina, preferiblemente de la HbA1c, en una muestra biológica aislada de un individuo en función del valor obtenido para el nivel de expresión del péptido de la invención en esa misma muestra biológica.

En la presente invención, se ha aislado y caracterizado una nueva variante estructural de la Hb que es codificada por el cambio de un aminoácido apolar hidrofóbico, la Leu, por otro de las mismas características, la Phe, en la posición 81 de la β globina. Este cambio responde a una mutación (sustitución de CTC por TTC) en el codon 81 (EF5) del gen de la β globina. Así, la secuencia de aminoácidos de dicha Hb o péptido de la invención es la SEQ ID NO:1yla secuencia de nucleótidos codificante para la SEQ ID NO: 1 es, preferiblemente, la SEQ ID NO: 2. Esta modificación no afecta a la función ni a la estabilidad del péptido de la invención con respecto a la HbA o Hb normal, aunque origina cambios estructurales que le confieren características que permiten su detección por métodos electroforéticos y cromatográficos.

Como muestran los ejemplos de la presente invención, los métodos de determinación de los niveles de la Hb (o métodos de cuantificación de la Hb) , preferiblemente de la HbA1c, detectan no solo ésta sino también el péptido de la invención en aquellas muestras biológicas aisladas de individuos que lo expresan. Así, los valores de expresión de este último interfieren en los valores de expresión de la primera, ofreciendo unos resultados de cuantificación de la Hb, preferiblemente de la HbA1c, alterados que no se corresponden con los reales. Por ello, la presente invención proporciona un método de obtención de datos útiles, de ahora en adelante "método de la invención", para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de Hb, preferiblemente de la HbA1c, que comprende cuantificar la cantidad de péptido de la invención en una muestra biológica aislada de un individuo en la que también se ha cuantificado la cantidad de la Hb de interés, preferiblemente de la HbA1c, cuyo valor se desea conocer por ser relevante para el diagnóstico y/o seguimiento de la enfermedad a estudiar. A continuación, en dicho método se normalizan los valores de expresión de esta última Hb en función de los valores de expresión del péptido de la invención. De este modo, se elimina la interferencia producida por los valores de expresión del péptido de la invención en los valores de expresión de la Hb de interés, preferiblemente la HbA1c, obteniéndose así datos útiles para el correcto diagnóstico y/o seguimiento de estas enfermedades, preferiblemente de la diabetes mellitus, en los pacientes que expresan el péptido de la invención.

Por todo ello, un aspecto de la invención se refiere a un péptido aislado, o "péptido de la invención", que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1. Otro aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica para la SEQ ID NO: 1, o a una secuencia nucleotídica complementaria a dicho polinucleótido aislado. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el polinucleótido aislado que...

 


Reivindicaciones:

1. Péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

2. Uso del péptido según la reivindicación 1 para la obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de hemoglobina.

3. Uso del péptido según la reivindicación 2 donde la hemoglobina es la HbA1c.

4. Uso del péptido según la reivindicación 3 donde la enfermedad es la diabetes mellitus.

5. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de hemoglobina en un individuo que comprende:

a. cuantificar la cantidad de hemoglobina en una muestra biológica aislada de un individuo,

b. cuantificar la cantidad de péptido según la reivindicación 1 en la muestra biológica aislada del paso (a) , y

c. normalizar el valor de cuantificación obtenido en el paso (a) en función del valor de cuantificación obtenido en el paso (b) .

6. Método según la reivindicación 5 donde la cuantificación de los pasos (a) y (b) se realiza mediante HPLC.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6 donde la normalización del paso (c) se realiza sumando, al valor de cuantificación obtenido en el paso (a) , el valor de cuantificación obtenido en el paso (b) .

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones5a7 donde la hemoglobina del paso (a) es la HbA1c.

9. Método según la reivindicación 8 donde la enfermedad es la diabetes mellitus.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 donde la muestra biológica aislada del paso (a) es sangre.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Servicio Andaluz de Salud Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital Clínico San Carlos

<120> "Variante estructural de la hemoglobina"

<130> IP1985.61

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 146

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 444

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPANA

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : C07K141805 (2006D01) G01N33/72 (2006D01)

NDD solicitud: 201030893 22 Fecha de presentación de la solicitud: 09D06D2010 32 Fecha de prioridad:

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoria @ Documentos citados Reivindicaciones afectadas

A LITTLE, R DRD et al D, ' A r eview of va riant hem oglobins interfering with hemoglobin A1c 1-10

measurement', JOURNAL OF DIABETES SCIENCE AND TECHNOLOGY, 2009, VolD 3, NoD 3,

pagina.

44. 451, ISSN: 1932-2968 (Electrónico) , todo el documentoD

A LITTLE, RDRD et alD, 'Effects of hemoglobin (Hb) E and HbD traits on measurements of glycated 1-10

Hb (HbA1c) by 23 methods', CLINICAL CHEMISTRY, 2008, VolD 54, NoD 8, Paginas 1277-1282,

ISSN: 0009-9147, todo el documentoD

A SAUDEK, CDDD et alD, 'A new look at screening and diagnosing diabetes mellitus', JOURNAL OF 1-10

CLINICAL ENDOCRINOLOGY & METABOLISM, 2008, VolD 93, NoD 7, paginas 2447-2453,

ISSN: 0021-972X, todo el documentoD

A LEE, SDTD et alD, 'Effects of 7 hemoglobin variants on the measurement of glycohemoglobin by 14 1-10

analytical methods', CLINICAL CHEMISTRY, 2007, VolD 53, NoD 12, paginas 2202-2205,

ISSN: 0009-9147, todo el documentoD

A SACKS, DDBD, 'Hemoglobin variants and hemoglobin A1c analysis: problem solved?', CLINICAL 1-10

CHEMISTRY, 2003, VolD 49, NoD 8, paginas 1245-1247, ISSN: 0009-9147, todo el documentoD

A BRY, LD et alD, 'Effects of hemoglobin variants and chemically modified derivatives on assays for 1-10

glycohemoglobin', CLINICAL CHEMISTRY, 2001, VolD 47, NoD 2, pagina.

15. 163,

ISSN: 0009-9147, todo el documentoD

A WO 0070350 A1 (CME TELEMETRIX INCD) 23D11D2000, 1-10

todo el documentoD

Categoria de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoria A: refleja el estado de la tecnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado despues de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado º para todas las reivindicaciones º para las reivindicaciones nD:

Fecha de realización del informe 26D01D2012 Examinador JD LD Vizan Arroyo Pagina 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TECNICA

ND de solicitud: 201030893

Documentación minima buscada (sistema de clasificación seguido de los simbolos de clasificación) C07K, G01N Bases de datos electrónicas consultadas durante la busqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, terminos de

busqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, BIOSIS, EMBASE, MEDLINE, EMBL-EBI

Informe del Estado de la Tecnica Pagina 2/4

OPINION ESCRITA

ND de solicitud: 201030893

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 26D01D2012

Declaración

Novedad (Art. .1 LP 11/198 ) Reivindicaciones 1-10 SI

Reivindicaciones NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/198 ) Reivindicaciones 1-10 SI

Reivindicaciones NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrialD Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y tecnico de la solicitud (Articulo 31D2 Ley 11/1986) D

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publicaD

Informe del Estado de la Tecnica Pagina 3/4

OPINION ESCRITA

ND de solicitud: 201030893

1. Documentos considerados.

A continuación se relacionanlos documentos pertenecientes al estado de la tecnica tomados en consideración para la realización de esta opiniónD

Doc. Numero Publicación o Identificación Fecha Pub.

D01 LITTLE, RDRD et alD, J. Diabetes Sci. Techno!D, (2009) , 3 (3) .

44. 51D 2009

D02 LITTLE, RDRD et alD, C!in. CherD, (2008) , 54 (8) : 1277-82D 2008

D03 SAUDEK, CDDD et alD, J. C!in. Endocrino!. MetabD, (2008) , 93 (7) : 2447-53D 2008

D04 LEE, SDTD et alD, C!in. CherD, (2007) , 53 (12) : 2202-5D 2007

D05 SACKS, DDBD, C!in. CherD, (2003) , 49 (8) : 1245-7D 2003

D06 BRY, LD et alD, C!in. CherD, (2001) , 47 (2) .

15. 63D 2001

D07 WO 0070350 A1

En D1-D7 revisan y valoran diferentes metodos de cuantificación de la hemoglobina glicosilada (HbA1c) en los que se tiene en cuenta las interferencias que diversas variantes estructurales de la hemoglobina (Hb) introducen en la determinación de HbA1cD

2. Declaración motivada segun los articulos 29. y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/198 , de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

1D NOVEDAD (ArtD 4D1D y ArtD 6D1D de la Ley de Patentes) yACTIVIDAD INVENTIVA (ArtD 4D1D y ArtD 8D1D de la Ley de Patentes) D

1D1D Reivindicaciones independientes 1 y 5D

1D1D1D El objeto de las reivindicaciones 1 y 5 consiste basicamente en un peptido caracterizado por la secuencia de aminoacidos SEQ ID No: 1 y en un metodo para la diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de Hb caracterizado por normalizar el valor de la cantidad de Hb en una muestra en función de la cantidad de peptido SEQ ID No: 1 en dicha muestraD

La secuencia SEQ ID No: 1 constituye una variante de la Hb segun la descripción de la solicitud de patente (cfD Pagina 4, lineas 1-11) , sin embargo, en el estado de la tecnica mas próximo (cfD D1-D7) , no se ha divulgado ninguna variante de Hb que comparta las mismas caracteristicastecnicas de la variante de la invenciónD Ademas, dicha variante no se deduce de una manera obvia combinando las variantes descritas previamenteD Por consiguiente, el objeto de protección de las reivindicaciones independientes 1 y 5 se considera que es nuevo y que tiene actividad inventiva sobre la base de los documentos D1-D7D

1D2DLa presente solicitud satisface el criterio establecido en el ArtD 4D1D de l a Ley de Patentes, pues el objeto de las reivindicaciones 1-10 es nuevo y tiene actividad inventiva de acuerdo con los ArtsD 6D1D y 8D1D de la Ley de PatentesD

Informe del Estado de la Tecnica Pagina 4/4


 

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