Vacunas quiméricas que comprenden el dominio lumenal de LAMP-1 o LAMP-2.

Una proteína quimérica, que comprende:

un dominio del antígeno que comprende al menos un epítopo;

un dominio lumenal de un polipéptido de LAMP-1 o LAMP-2 y un dominio transmembrana; en la que el antígeno está situado entre el dominio lumenal y el dominio transmembrana; en la que el dominio lumenal dirige las proteínas tanto de membrana como no de membrana a un compartimento endosomal/lisosomal en una célula y/o a un organelo relativo a lisosomas.

Vacunas quiméricas que comprenden el dominio lumenal de LAMP-1 o LAMP-2

Aplicaciones relacionadas Esta solicitud reivindica la prioridad en virtud de 35 U.S.C. § 119 (e) para la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. Nº 60/281.607, Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. 60/281.608 y Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. 60/281.621, todas presentadas el 5 de abril de 2.001.

Concesiones del gobierno El trabajo contenido en esta solicitud se realizó en virtud de la concesión del gobierno A1 41908 de los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno puede tener ciertos derechos en esta invención.

Campo de la invención La invención se refiere a vacunas quiméricas que comprenden secuencias de antígenos y dominios de transporte, ácidos nucleicos que codifican los mismos y métodos para usar los mismos.

Antecedentes de la invención El reconocimiento de antígenos y la respuesta en el sistema inmunitario de los mamíferos están gobernados, en parte, por la interacción entre células T y células presentadoras de antígenos. Vía su receptor de células T heterodímero, una célula T reconoce fragmentos peptídicos de antígenos presentados como un complejo con moléculas principales de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés) (Yewdell and Bennenk, Cell 62: 203, 1.990; Davis and Bjorkman, Nature 334: 395, 1.988) . Hay dos sistemas celulares paralelos de células T y moléculas presentadoras de antígenos que distinguen entre dos tipos de antígenos, antígenos extraños introducidos desde fuera de la célula (tales como productos químicos extraños, bacterias y toxinas) y antígenos endógenos producidos dentro de la célula (tales como virus o productos oncogénicos) (Bevan, Nature 325: 192, 1.987; Braciale, et al., Immunol. Rev. 98: 95, 1.987; Germain, Nature 322: 687, 1.986) .

Hay dos clases generales de moléculas del MHC, moléculas del MHC de clase I y MHC de clase II. Las moléculas del MHC de clase I presentan antígenos peptídicos procedentes en general de proteínas producidas de manera endógena para las células Tc CD8+, la célula T citotóxica predominante que es específica del antígeno. El sistema proteolítico relativo a la clase I de MHC está presente prácticamente en todas las células para el fin de degradar las proteínas muy anormales y las moléculas de vida corta o las proteínas víricas. Se cree que esta proteolisis no es lisosomal y que implica conjugación covalente dependiente de ATP a la ubiquitina polipeptídica (Goldberg, et al., Nature 357: 375, 1.992) . Se postula que los fragmentos peptídicos, posiblemente junto con un complejo mayor de proteasomas, entran en el retículo endoplasmático o algún otro tipo de compartimento exocítico (distinto del compartimento endocítico/lisosomal) . Allí se unen a moléculas de la clase I de MHC y siguen la ruta secretora constitutiva desde el retículo endoplasmático a través del Golgi a la superficie de la célula donde son presentados por la proteína del MHC I al receptor de antígenos de las células T citotóxicas CD3-CD8.

Las moléculas de la clase II del MHC presentan en general antígenos que son introducidos desde el exterior de las células en un procedimiento que implica la absorción celular de las moléculas que comprenden los antígenos y generación de fragmentos peptídicos antigénicos en organelos endosomales/lisosomales. Se cree en general que el procedimiento relativo a la clase II del MHC por el que los antígenos extraños son tratados en las células presentadoras de antígenos (APC, por sus siglas en inglés) tiene lugar en una ruta endocítica. Los antígenos llevados a la célula por pinocitosis en fase fluida, endocitosis absortiva o fagocitosis entran en un compartimento endosomal/lisosomal donde se convierten las moléculas grandes en péptidos por digestión a través de las proteasas y otras hidrolasas. Durante este procedimiento, los péptidos más pequeños inmunodominantes entran en contacto con, y están unidos por, moléculas de la clase II del MHC y los péptidos son transportados a la superficie de la célula. En la superficie de la célula de la APC, estos péptidos cortos junto con moléculas de la clase II del MHC se unen al complejo CD3-CD4 en la superficie de las células T auxiliares, activando la replicación y la función inmunitaria de estas células. Después de esta interacción, las células T auxiliares liberan linfocinas que estimulan la proliferación y diferenciación de los leucocitos e inhiben su emigración desde el sitio de infección. En general, se requiere la activación de las células T auxiliares por APC cargada de péptidos para la acción óptima de las células B y las células T y así es necesaria para la función apropiada del sistema inmunitario.

(Guagliardi, et al., Nature 343: 133, 190) . Los antígenos tratados parcialmente y los antígenos fácilmente degradables pueden proporcionar péptidos que se pueden combinar con clase II del MHC en el compartimento endosomal temprano. Sin embargo, se soporta la prueba de que el sitio principal de tratamiento de antígeno y asociación con clase II del MHC tenga lugar en el endosoma tardío, el lisosoma o un compartimento distinto relativo al lisosoma (Neefjes, et al., Cell 61: 171, 1.990) .

Las funciones de los dos tipos de células T son significativamente diferentes, como se implica por sus nombres. Las células T citotóxicas erradican los patógenos intracelulares y los tumores por lisis directa de las células y por secreción de citocinas tales como el interferón . Las células T auxiliares también pueden lisiar células, pero su función principal es segregar citocinas que activen las actividades de las células B (células productoras de anticuerpos) y otras células T y así mejoran ampliamente la respuesta inmunitaria a los antígenos extraños, incluyendo mecanismos de respuesta mediados por anticuerpos y mediados por Tc.

Las células T CD4+ son el principal fenotipo de células T auxiliares en la respuesta inmunitaria. Esta función predominante es generar citocinas que regulen esencialmente todas las demás funciones de la respuesta inmunitaria. Los animales con células CD4+ reducidas o los seres humanos con células CD4+ reducidas (como en pacientes con SIDA) fracasan en la generación de respuestas de anticuerpos, respuestas de células T citotóxicas o respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado. Se conoce en la técnica que las células T auxiliares son críticas en la regulación de respuestas inmunitarias.

También se ha demostrado que las células restringidas de clase II del MHC CD4+ presentan capacidad citotóxica en una serie de sistemas. Uno de los casos relevantes de enfermedad más importantes en que se han demostrado células T citotóxicas CD4+ es en la respuesta a fragmentos de la proteína gp120 del VIH (Poly defkis, et al., J. Exp. Med. 171: 875, 1.990) . Las células restringidas de la clase II del MHC CD4+ también han demostrado que son críticas en la generación de respuestas inmunitarias sistémicas frente a los tumores. En un modelo de transferencia adoptiva, las células CD4+ son críticas en la eliminación de tumores FBL en ratones. En el modelo de inmunoterapia activa de Golumbek, et al. Science 254: 713, 1.991, las células CD4+ también se ha demostrado que son críticas en la respuesta inmunitaria sistémica frente a una serie de tumores malignos sólidos diferentes.

Debido a que las células restringidas de la clase II del MHC CD4+ parecen ser las células de la memoria críticas en el arma de las células T de la respuesta inmunitaria, una estrategia apropiada de vacunación es generar poblaciones de células T de memoria restringidas de clase II del MHC específicas para el antígeno CD4+.

Las vacunas tradicionales cuentan con organismos completos, cepas patógenas que han sido matadas o cepas con patogenicidad atenuada. Por una parte, estas vacunas corren el riesgo de introducir la enfermedad para cuya prevención se diseñan si la atenuación es insuficiente o si sobreviven suficientes organismos a la etapa de muerte durante la preparación de la vacuna. Por otra parte, dichas vacunas presentan una infectividad reducida y con frecuencia son insuficientemente inmunógenas, dando como resultado una protección inadecuada de la vacunación.

Recientemente, se han usado técnicas biológicas moleculares en un intento para desarrollar nuevas vacunas basadas en proteínas antigénicas individuales a partir de los organismos patógenos. Conceptualmente, el uso de péptidos antigénicos más bien que organismos completos evitaría la patogenicidad al tiempo que se proporcionaría una vacuna con los epítopos más inmunógenos. Sin embargo, se ha encontrado que los péptidos puros o los carbohidratos tienden a ser inmunógenos débiles,... [Seguir leyendo]

1. Una proteína quimérica, que comprende:

un dominio del antígeno que comprende al menos un epítopo;

un dominio lumenal de un polipéptido de LAMP-1 o LAMP-2 y un dominio transmembrana; en la que el antígeno está situado entre el dominio lumenal y el dominio transmembrana; en la que el dominio lumenal dirige las proteínas tanto de membrana como no de membrana a un compartimento endosomal/lisosomal en una célula y/o a un organelo relativo a lisosomas.

2. La proteína quimérica según la reivindicación 1, que comprende además un polipéptido Gag.

3. La proteína quimérica según la reivindicación 2, en la que el polipéptido Gag es insertado en una porción del dominio lumenal del polipéptido de LAMP.

4. La proteína quimérica según la reivindicación 1, en la que la proteína comprende una secuencia polipeptídica de un receptor endocítico y en la que dicha secuencia polipeptídica comprende un dominio de transporte endosomal.

5. La proteína quimérica según una de reivindicaciones 1 a 4, en la que la proteína comprende además uno o más dominios seleccionados del grupo que consiste en: un domino objetivo para fijar como objetivo una proteína a un compartimento endosomal/lisosomal u organelo relacionado con lisosomas; un dominio señal; un dominio transmembrana; un dominio de di-leucina; un dominio de unidades Tyr; un dominio rico en prolina y un dominio Ser-Val-Val.

6. La proteína quimérica según la reivindicación 5, en la que el dominio de la unidad Tyr comprende la secuencia tetrapeptídica Tyr-Xaa-Xaa-Xbb, en la que Xaa es cualquier aminoácido y Xbb es un aminoácido hidrófobo.

7. La proteína quimérica según una de reivindicaciones 1 a 6, en la que el compartimento y/u organelo comprende moléculas de clase II del MHC.

8. La proteína quimérica según una de reivindicaciones 1 a 7, en la que el transporte al compartimento y/u organelo da como resultado tratamiento del antígeno.

9. La proteína quimérica según la reivindicación 8, en la que el antígeno tratado se expresa en la superficie de una célula unida a una molécula de clase II del MHC.

10. La proteína quimérica según la reivindicación 4, en la que el receptor endocítico comprende el dominio de transporte de un receptor seleccionado del grupo que consiste en: un receptor Fc, receptor complemento, receptor eliminador, integrina, lectina, polipéptido DEC-205, polipéptido gp200-MR6, receptor de tipo Toll, receptores de proteínas de choque térmico, receptores de cuerpos apoptóticos o cuerpos necróticos.

11. La proteína quimérica según una de reivindicaciones 1 a 10, en la que el antígeno es seleccionado del grupo que consiste en: una porción de un material antigénico a partir de un organismo patogénico, una porción de un material antigénico de un polipéptido específico de cáncer y una porción de un material antigénico de una molécula asociada con una respuesta fisiológica anormal.

12. La proteína quimérica según la reivindicación 11, en la que el organismo patogénico es un virus, microorganismo

o parásito.

13. La proteína quimérica, según la reivindicación 12, en la que el virus es un virus del VIH.

14. La proteína quimérica según la reivindicación 11, en la que la respuesta fisiológica anormal es una enfermedad autoinmunitaria, una reacción alérgica, cáncer, una reacción a un trasplante o injerto, una reacción de hipersensibilidad o una enfermedad congénita.

15. La proteína quimérica según una de reivindicaciones 1 a 14, en la que el compartimento endosomal es seleccionado del grupo que consiste en: MIIC, CIIV, melanosomas, gránulo secretor, gránulo lítico, gránulo denso en plaquetas, gránulo basófilo, gránulo de Birbeck, fagolisosoma y lisosoma secretor.

16. La proteína quimérica según una de reivindicaciones 1 a 15, en la que la proteína quimérica provoca una respuesta inmunitaria específica del antígeno.

17. La proteína quimérica según una de reivindicaciones 1 a 16, en la que dicho compartimento u organelo

comprende un polipéptido LAMP.

18. Una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a

17.

19. Un vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 18, en el que la molécula de ácido nucleico está ligada de manera operable a una secuencia de control de la expresión.

20. El vector según la reivindicación 19, en el que el vector es un vector de vacuna.

21. Un vehículo de suministro que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 18.

22. El vehículo de suministro según la reivindicación 21, en el que el vehículo es a base de lípidos, a base de virus o a base de células.

23. Una célula que comprende el vector según la reivindicación 19 ó 20.

24. La célula según la reivindicación 23, en la que la célula es una célula presentadora de antígeno.

25. La célula según la reivindicación 24, en la que la célula presentadora de antígeno es una célula presentadora de antígeno profesional o una célula presentadora de antígeno lograda por ingeniería.

26. La célula según una de reivindicaciones 23 a 25, en la que la célula expresa una molécula de clase II del MHC.

27. La célula según una de reivindicaciones 24 a 26, en la que la célula presentadora de antígeno no expresa ninguna señal co-estimuladora y el antígeno es un auto-antígeno.

28. Un estuche que comprende una pluralidad de células que comprende el vector según la reivindicación 19, en el que al menos dos de las células expresan diferentes moléculas de clase II del MHC y cada célula comprende el mismo vector.

29. Un estuche que comprende un vector según la reivindicación 20 y una célula para recibir el vector.

30. Un animal transgénico no humano que comprende al menos una célula según las reivindicaciones 23 a 27.

31. Uso de una célula según una de reivindicaciones 23 a 27, para la fabricación de un medicamento para generar una respuesta inmunitaria en un animal a un antígeno, en el que la célula expresa la proteína quimérica en el animal.

32. El uso según la reivindicación 31, en el que la célula comprende una molécula de clase II del MHC compatible con proteínas de MHC del animal, de manera que el animal no genera una respuesta inmunitaria contra la molécula de clase II del MHC.

33. El uso según una de reivindicaciones 31 ó 32, en el que el animal es un ser humano.

34. El uso según una de reivindicaciones 31 a 33, en el que la célula no expresa ninguna señal co-estimuladora y el antígeno es un auto-antígeno.

35. Uso de un vector según una de reivindicaciones 19 ó 20, para la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmunitaria a un antígeno.

36. El uso según la reivindicación 35, en el que el vector es infeccioso para una célula en el animal.

37. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 36, en el que el antígeno es seleccionado del grupo que consiste en: una porción de un material antigénico de un organismo patogénico, una porción de un material antigénico de un polipéptido específico de cáncer y una porción de un material antigénico de una molécula asociada a una respuesta fisiológica anormal.

38. El uso según la reivindicación 37, en el que el organismo patogénico es un virus, microorganismo o parásito.

39. El uso según la reivindicación 38, en el que el virus es un virus del VIH.

40. El uso según la reivindicación 37, en el que la respuesta fisiológica anormal es una enfermedad autoinmunitaria, una reacción alérgica, cáncer o una enfermedad congénita.

41. Una proteína quimérica según la reivindicación 1, que comprende además una cola citoplasmática de DEC205.