Vacunas de ADN que codifican proteínas de choque térmico.

Una vacuna de ADN que comprende una construcción recombinante,

comprendiendo la construcciónrecombinante una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de choque térmico de mamífero, en laque la proteína de choque térmico de mamífero es HSP90; en la que la secuencia de ácidos nucleicos está unida demanera operativa a una o más secuencias de control de la transcripción, en un sistema de expresión adecuado, quepermite la expresión in vivo de la proteína codificada en un huésped humano.

Vacunas de ADN que codifican proteínas de choque térmico Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria inflamatoria mediada por células T. En particular, la presente invención se refiere a una vacuna de ADN que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de choque térmico 90 (HSP90) de mamíferos, una composición farmacéutica que comprende una HSP90 codificadora de construcción recombinante y un método in vitro para tratar células obtenidas de un individuo con una enfermedad autoinmunitaria inflamatoria mediada por células T.

Antecedentes de la invención Aunque el sistema inmunitario normal está estrechamente regulado, las anomalías en las respuestas inmunitarias no son raras. En algunos casos, el sistema inmunitario actúa de manera inapropiada y reacciona a un componente del huésped como si fuera, de hecho, extraño. Tal respuesta da como resultado una enfermedad autoinmunitaria, en que el sistema inmunitario del huésped ataca al propio tejido del huésped. Las células T, como reguladores primarios del sistema inmunitario, efectúan directamente o indirectamente tales patologías autoinmunitarias. Enfermedades autoinmunitarias mediadas por células T se refiere a cualquier afección en que una respuesta inapropiada de las células T es un componente de la enfermedad. Esto incluye tanto enfermedades mediadas directamente por células T como también enfermedades en que una respuesta inapropiada de las células T contribuye a la producción de anticuerpos anormales.

Se cree que numerosas enfermedades resultan de mecanismos autoinmunitarios. Destacan entre éstas artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, diabetes de Tipo I, miastenia grave y pénfigo vulgar. Las enfermedades autoinmunitarias afectan a millones de individuos en el mundo y el coste de estas enfermedades, en términos de gastos de tratamiento reales y pérdida de productividad, se mide en miles de millones de dólares al año.

La artritis adyuvante (AA) es una enfermedad autoinmunitaria experimental que modela diversas características de la artritis reumatoide humana (1) . La AA está inducida en ratas de Lewis por inmunización con Mycobacterium tuberculosis (Mt) muerta por el calor suspendida en Adyuvante de Freund Incompleto (IFA, por sus siglas en inglés) (1) . La reactividad de las células T frente a la proteína de choque térmico de 65 kDa (HSP65) micobacteriana está implicada en la evolución de AA. Las células T específicas de HSP65 dirigidas contra un epítopo formado por aa 180-188 (2) experimentan reacción cruzada con un auto-antígeno presente en el cartílago (3) y pueden transferir adoptivamente AA (4, 5) . Sin embargo, la vacunación con HSP65 o péptidos HSP65 también puede evitar el desarrollo de AA (6-11) . Se piensa que las propiedades reguladoras de HSP65 en AA implican la activación de células-T que experimentan reacciones cruzadas con la proteína de choque térmico de 60 kDa (HSP60) endógena (12) . Esta hipótesis se soporta por el hallazgo de que la inmunización con un virus de vaccinia recombinante que codifica HSP60 humana (aproximadamente 95% homólogo a HSP60 de rata) evita (13) o trata (14) la AA. El autor de la presente invención ha informado recientemente que la vacunación de ADN con HSP60 humana evita la AA (15) . La protección de AA estaba asociada con la activación de células-T que responde a HSP60 (15) . La molécula de hsp60 humana se designaba antiguamente HSP65, pero ahora se designa HSP60 en vista de información más precisa de peso molecular; por cualquier denominación, la proteína es la misma.

Un método preferible para tratar enfermedades autoinmunitarias incluye modular el sistema inmunitario de un paciente para ayudar a los mecanismos de defensa naturales del paciente. Los reactivos y métodos tradicionales usados para intentar regular una respuesta inmunitaria en un paciente también dan como resultado efectos secundarios no deseados y presentan una eficacia limitada. Por ejemplo, los reactivos inmunodepresores (por ejemplo, ciclosporina A, azatioprina y prednisona) usados para tratar pacientes con enfermedades autoinmunitarias también suprimen la respuesta inmunitaria completa del paciente, aumentando de ese modo el riesgo de infección. Además, los reactivos inmunofarmacológicos usados para tratar el cáncer (por ejemplo, interleucinas) son efímeros en la circulación de un paciente y son ineficaces salvo a grandes dosis. Debido a la importancia médica de la regulación inmunitaria y las insuficiencias de los reactivos inmunofarmacológicos existentes, los reactivos y métodos para regular partes específicas del sistema inmunitario han sido el objeto de estudio durante muchos años.

La patente europea EP 262710 de Cohen et al. desvela el uso de HSP65 o fragmentos de la misma para la preparación de composiciones para el alivio, tratamiento y diagnóstico de enfermedades autoinmunitarias, especialmente afecciones artríticas. La patente europea EP 322990 de Cohen et al. desvela que un polipéptido con secuencia de aminoácidos 172-192 de HSP65 es capaz de inducir resistencia a artritis autoinmunitaria y enfermedades autoinmunitarias similares. La patente internacional WO 92/04049 de Boog et al. desvela péptidos procedentes de proteína HSP-65 de Mycobacterium tuberculosis que contienen al menos 7 restos de aminoácidos y presenta reconocimiento de antígenos por linfocitos T en el tratamiento de la artritis y el rechazo de órganos.

La patente internacional WO 01/57056 de Karin desvela un método para tratar la artritis reumatoide. El método que

comprende la etapa de expresión dentro del individuo de al menos una porción inmunológicamente reconocible de una citocina a partir de un polinucleótido exógeno que codifica al menos una porción de la citocina, en el que un nivel de expresión de al menos una porción de la citocina es suficiente para inducir la formación de inmunoglobulinas de anti-citocina que sirven para neutralizar o mejorar la actividad de una citocina endógena respectiva y/o capaz de experimentar reacciones cruzadas, para tratar de ese modo la artritis reumatoide. La patente de EE.UU. 6.316.420 para Karin y colaboradores desvela además vacunas de citocina de ADN y uso de las mismas para inmunidad protectora contra la esclerosis múltiple.

La patente internacional WO 02/16549 de Cohen et al., cedida al cesionario de la presente invención, se refiere a vacunas de ADN útiles para la prevención y el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias en marcha. Las composiciones y los métodos de la invención caracterizan el oligonucleótido CpG, preferiblemente en un motivo flanqueado por dos purinas 5' y dos pirimidinas 3'. Las vacunas comprenden opcionalmente además ADN que codifica un péptido o un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en variantes Hsp60, p277 o p277. Esa descripción se refiere a métodos y composiciones para el tratamiento mejorado de la enfermedad autoinmunitaria en marcha en general y Diabetes Sacarina Dependiente de Insulina (IDDM, por sus siglas en inglés) en particular.

La patente de EE.UU. 5.993.803 desvela que cuando HSP60 o péptidos y análogos de los mismos, se administran a un individuo receptor antes de trasplante de un órgano o tejido, la autoinmunidad para HSP60 es regulada hacia abajo, dando como resultado la prevención o supresión de rechazo del injerto del órgano o tejido trasplantado.

La patente internacional WO 00/27870 de Naparstek y colaboradores desvela una serie de péptidos relacionados procedentes de proteínas de choque térmico HSP65 y HSP60, sus secuencias, anticuerpos y uso como vacunas para conferir inmunidad frente a trastornos autoinmunitarios y/o inflamatorios tales como la artritis. Se pretende por los autores que estos péptidos representen la secuencia más corta o epítopo que esté implicado en la protección de cepas de rata susceptibles contra la artritis inducida por adyuvante. Estas secuencias desvelan además lo que los autores identifican como la "unidad protectora" común.

La patente internacional WO 01/17554 se refiere a métodos para la prevención y el tratamiento de rechazo del injerto por administración de composiciones de complejos de proteínas de choque térmico unidas mediante enlaces no covalentes a moléculas de antígeno. Específicamente desvela el uso de una gp96 purificada parcialmente complejada con péptidos para inhibir el rechazo del injerto de piel.

Existe una necesidad desde hace mucho tiempo de un medio eficaz de curación o mejora de enfermedades autoinmunitarias inflamatorias mediadas por células T. Ninguna de las técnicas anteriores desvela vacunas de ADN que codifican proteínas de choque térmico para tratar enfermedades... [Seguir leyendo]

1. Una vacuna de ADN que comprende una construcción recombinante, comprendiendo la construcción recombinante una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de choque térmico de mamífero, en la que la proteína de choque térmico de mamífero es HSP90; en la que la secuencia de ácidos nucleicos está unida de manera operativa a una o más secuencias de control de la transcripción, en un sistema de expresión adecuado, que permite la expresión in vivo de la proteína codificada en un huésped humano.

2. La vacuna de ADN según la reivindicación 1, en la que dicha proteína de choque térmico de mamífero es HSP90 humana.

3. La vacuna de ADN según la reivindicación 1, en la que dichas secuencias de control de la transcripción son secuencias de control de CMV.

4. La vacuna de ADN según la reivindicación 1, en la que dicha contrucción recombinante se incorpora a un vector de expresión de eucariotas, que es pcDNA3.

5. La vacuna de ADN según la reivindicación 1, que está en la forma de una composición farmacéutica y comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

6. La composición farmacéutica según la reivindicación 5, en la que dicho portador comprende un vehículo de suministro que suministra las secuencias de ácidos nucleicos a un individuo, vehículo de suministro que es un liposoma.

7. La composición farmacéutica según la reivindicación 5, en la que dicha composición es adecuada para inyección intramuscular.

8. Un método in vitro para tratar células obtenidas de un individuo con una enfermedad autoinmunitaria inflamatoria mediada por células T que comprende la etapa de transinfectar células obtenidas de un individuo con una enfermedad autoinmunitaria inflamatoria mediada por células T in vitro con una construcción recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica una proteína de choque térmico de mamífero en la que la proteína de choque térmico de mamífero es HSP90; estando dicha secuencia de ácidos nucleicos unida de manera operativa a una o más secuencias de control de la transcripción.

9. El método según la reivindicación 8, en el que dicha proteína de choque térmico de mamífero es HSP90 humana.

10. El método según la reivindicación 9, en el que dicha enfermedad autoinmunitaria inflamatoria mediada por células T se selecciona de: artritis reumatoide, artritis de colágeno II, esclerosis múltiple, neuritis autoinmune, lupus eritematoso sistémico, soriasis, diabetes de comienzo juvenil, enfermedad de Sjogren, enfermedad tiroidea, sarcoidosis, uveitis autoinmune, enfermedad del intestino inflamado (Crohn y colitis ulcerosa) o hepatitis autoinmune.

11. El método según la reivindicación 10, en el que dicha enfermedad autoinmunitaria inflamatoria mediada por células T es artritis reumatoide.

12. Una vacuna de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria inflamatoria mediada por células T.

13. La vacuna de ADN para uso según la reivindicación 12, en la que dicha enfermedad autoinmunitaria inflamatoria mediada por células T se selecciona de: artritis reumatoide, artritis de colágeno II, esclerosis múltiple, neuritis autoinmune, lupus eritematoso sistémico, soriasis, diabetes de comienzo juvenil, enfermedad de Sjogren, enfermedad tiroidea, sarcoidosis, uveitis autoinmune, enfermedad del intestino inflamado (Crohn y colitis ulcerosa) o hepatitis autoinmune.

14. La vacuna de ADN para uso según la reivindicación 15, en la que dicha enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide.

15. Una composición farmacéutica que comprende:

(a) una construcción recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de choque térmico de mamífero en la que la proteína de choque térmico de mamífero es HSP90; en la que dicha secuencia de ácidos nucleicos está unida de manera operativa a una o más secuencias de control de la transcripción y

(b) un portador farmacéuticamente aceptable; en la que la composición farmacéutica es para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria inflamatoria mediada por células T.

16. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 15, en la que dicho portador comprende un vehículo de suministro que suministra las secuencias de ácidos nucleicos a un individuo, vehículo de suministro que es un liposoma.

17. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 15, en la que dicha enfermedad inflamatoria mediada por células T es artritis reumatoide.

18. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 17, en la que dicha composición es para administrar a un individuo previamente a la aparición de síntomas de la enfermedad. 10

19. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 17 ó 18, en la que dicha composición es adecuada para inyección intramuscular.