Vacuna contra la infección por Actinobacillus pleuropneumoniae que comprende la toxina ApxIV purificada.

Una vacuna sub-unitaria para la protección de animales contra la infección por una bacteria de la especieActinobacillus pleuropneumoniae,

caracterizada porque dicha vacuna comprende toxina ApxIV purificada y unvehículo farmacéuticamente aceptable.

Vacuna contra la infección por Actinobacillus pleuropneumoniae que comprende la toxina ApxIV purificada La presente invención se refiere a bacterias vivas atenuadas del género Actinobacillus pleuropneumoniae, que tienen una mutación en el gen que codifica una toxina, a los procedimientos para la producción de tal bacteria, a las vacunas que comprenden tal bacteria, a los procedimientos para la producción de tales vacunas, a las vacunas que comprenden una toxina, a los procedimientos para la producción de tales vacunas y procedimientos para la protección de animales contra la infección por bacterias del género Actinobacillus pleuropneumoniae.

Las bacterias que pertenecen al género Actinobacillus producen todas las denominadas toxinas RTX (permanece RTX para repetirse en toxina) .

La presencia de estas toxinas RTX es lo que contribuye sobre todo al carácter patógeno de estas bacterias.

Las toxinas RTX han sido extensamente revisadas por Braun y col. (Critical Rev. in Microbiol. 18 (2) : 115-158 (1991) ) . También se han revisado las toxinas RTX de las cepas Gram-negativas por Welch, R.A. (Molecular Microbiology 5/3: 521-528 (1991) ) y por Welch y col. (Inf. Agents and Disease 4: 254-272 (1995) ) .

Todas las toxinas RTX conocidas muestran algún tipo de actividad citotóxica o citolítica. Sin embargo, las células diana y la especificidad del huésped difieren, dependiendo de la toxina y de las diferencias en la acilación (McWhinney y col.; J. Bact. 174: 291-297 (1992) and Hackett y col.; J. Biol. Chem. 270: 20250-20253 (1995) ) . Por el resultado en las diferentes células diana, las diferentes toxinas de la familia de las toxinas RTX se conocen por ejemplo como hemolisina, citolisina o citotoxina.

El género Actinobacillus comprende varias especies diferentes, entre ellas, Actinobacillus pleuropneumoniae, A. actinomycetemcomitans, A. suis, A. rossii, A. equuli y A. lignieresii.

El Actinobacillus pleuropneumoniae produce toxinas RTX dependientes del serotipo que son citotóxicas/citolíticas para los eritrocitos del cerdo, caballo, bovinos y ser humano, para los neutrófilos del conejo y porcinos y para los macrófagos alveolares porcinos. (Rosendal y col; Am. J. Vet. Res. 49: 1053-1058 (1988) , Maudsley J.R. y Kadis S; Can. J. Microbiol. 32: 801-805 (1986) , Frey J. y Nicolet J.; Inf. & Imm, 56:2570-2575 (1988) , Bendixon y col; Inf. & Imm, 33: 673-676 (1981) , Kamp, E.M. y van Leengoed, L.A.M.G.; J. Clin. Microbiol. 27: 1187-1191 (1989) ) .

Las infecciones por Actinobacillus en cerdos son la causa de enormes pérdidas económicas para la industria porcina, debido a la mortalidad aguda en cerdos jóvenes y a la reducción de la ganancia de peso en los mayores.

La organización genética de los operones implicados en la síntesis, activación y transporte de las toxinas RTX en bacterias Gram-negativas ha sido revisada recientemente por Coote, J.G. (FEMS Microbiology reviews 88: 137-162 (1992) ) . Frey ha revisado específicamente las tres toxinas RTX conocidas de Actinobacillus pleuropneumoniae en Bacterial Protein Toxins, Zbl Bakt. Suppl. 24, p. 322-, Freer y coll. (Eds.) , Gustaf Fischer, Stutttgart, Jena, New York, 1994.

En el Actinobacillus pleuropneumoniae, este tipo de operón RTX contiene cuatro genes: el gen real de la toxina (A) , un gen activador (C) , y dos genes (B y D) que codifican las proteínas implicadas en la secreción de la toxina en el medio circundante. El primer producto de la traducción del gen real de la toxina (A) no es una proteína tóxica, la actividad tóxica se activa por un producto del gen-activador (C) .

Hasta hace poco, se asumía que solamente existían tres toxinas RTX en las especies de Actinobacillus, y que todas ellas tenían la organización genética descrita anteriormente o al menos que tenían el gen de la toxina (A) y el gen activador (C) .

Estas tres toxinas RTX, ApxI, Apx-II, y Apx-III tenían respectivamente, una pronunciada actividad hemolítica (ApxI) , una actividad hemolítica media (Apx-II) o una actividad citotóxica para los macrófagos (Apx-III) .

Las distintas actividades tóxicas están divididas más o menos aleatoriamente en los serotipos. Hay cuatro subgrupos:

un subgrupo A, representado por los serotipos 1, 5, 9 y 11, que producen ApxI y Apx-II,

un subgrupo B, representado por los serotipos 2, 3, 4, 6 y 8, que producen Apx-II y Apx-III,

un subgrupo C, representado por el serotipo 10, que produce solo ApxI

un subgrupo D, representado por los serotipos 7 y 12, que produce solamente Apx-II.

Se sabe que ApxI, -II y –III, son todas elementos esenciales de las vacunas universales contra la infección por Actinobacillus pleuropneumoniae: una vacuna que no comprende al menos Apxl, -II, y –III no proporcionará protección contra todos los serotipos de Actinobacillus pleuropneumoniae. Igualmente, una vacuna que no comprenda al menos las toxinas Apx de un serotipo específico ni siquiera inducirá protección contra ese único serotipo.

Se han descrito anteriormente subunidades vacunales basadas en toxinas RTX sintetizadas in vitro a partir de A. pleuropneumoniae que han perdido su toxicidad, por ejemplo en la Patente Europea EP Nº 0.354.628, en la que se desvelan subunidades vacunales que se basan en una hemolisina y una citotoxina de A. pleuropneumoniae y en la Patente Europea EP 0.453.024, en la que se desvelan subunidades vacunales de A. pleuropneumoniae basadas en hemolisinas, citotoxinas y proteínas de la membrana externa.

Sin embargo hay cuatro desventajas importantes en las subunidades vacunales en general:

! se necesitan grandes cantidades de material antigénico para que se active adecuadamente del sistema inmunitario, ! normalmente, sólo se activa la inmunidad de células B, 10 ! varios agentes protectores solo se activan in vivo, y por tanto no pueden estar presentes en las subunidades vacunales.

! una bacteria patógena viva tiene muchas moléculas inmunogénicas importantes, tales como las Proteínas de Membrana Externa y polisacáridos capsulares, que son todas ellas potencialmente importantes para la protección y por tanto para incluirse en una vacuna sub-unitaria eficaz.

Como en los problemas obvios mencionados en los puntos uno y dos, especialmente el cuarto punto hace que sea difícil fabricar una vacuna sub-unitaria eficaz.

Esto está, por ejemplo, ilustrado para la vacuna sub-unitaria de A. pleuropneumoniae desvelada en la Patente Europea EP Nº 0.453.024, mencionada anteriormente, en la que se combinan cuatro subunidades distintas (tres toxinas RTX y una proteína de membrana externa) en una vacuna.

Está claro que, con el fin de superar las desventajas de las subunidades vacunales contra las infecciones por Pasteurellaceae, sería muy deseable una vacuna viva atenuada.

Una vacuna viva atenuada tiene las siguientes ventajas puede administrarse en dosis bajas (es autorreplicante) imita fielmente la infección por el natural / tipo silvestre

proporciona todos los antígenos posibles inmunológicamente importantes al mismo tiempo.

Sin embargo, a pesar de las claras ventajas, no hay disponible comercialmente ninguna vacuna viva basada en Actinobacillus pleuropneumoniae anterior a la presente invención.

La razón para ello está en la siguiente paradoja: como se mencionó antes, las ApxI, -II y -III, son todas elementos esenciales de las vacunas universales contra la infección por Actinobacillus pleuropneumoniae. Por tanto las vacunas vivas tienen que producir estas tres toxinas RTX. Estas tres toxinas RTX sin embargo son factores de alta virulencia en todas las especies de Actinobacillus (véase por ejemplo, Coote, J.G.; FEMS Microbiology reviews 88: 137-162 (1992) , Tascon y col.; Mol. Microbiol. 14: 207-216 (1994) , Jansen y col.; Inf. & Imm. 63: 27-37 (1995) ) .

La deleción de las toxinas RTX con el fin de atenuar la virulencia de las cepas vivas de App es técnicamente posible, pero esto no proporciona una solución al dilema: tales cepas RTX negativas serían inútiles como cepas para una vacuna viva atenuada puesto que no inducirían inmunidad a largo plazo en el huésped contra la actividad hemolítica/citotóxica de las cepas de Actinobacillus pleuropneumoniae de campo.

Sin embargo, no se conocen actualmente factores de virulencia que, aunque siendo importantes para la inducción de la inmunidad, tengan un papel menos importante en construir la inmunidad que ApxI, -II, y –III, y que por tanto se podrían eliminar.

Por tanto, sería muy deseable tener un sitio en el genoma de App que contribuyera a la virulencia y de esta manera al modificarse produjera una cepa de App atenuada, mientras que al mismo tiempo fuera, aunque... [Seguir leyendo]

1. Una vacuna sub-unitaria para la protección de animales contra la infección por una bacteria de la especie Actinobacillus pleuropneumoniae, caracterizada porque dicha vacuna comprende toxina ApxIV purificada y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende un adyuvante.

3. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque la vacuna está en forma liofilizada.

4. La vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque comprende adicionalmente uno o más antígenos de microorganismos o virus patógenos para el cerdo.

5. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizada porque comprende adicionalmente uno o más

antígenos seleccionados de entre el grupo que consiste en virus del Síndrome Respiratorio Reproductor Porcino (SRRP) , virus de la Pseudorrabia, virus de la Influenza Porcina, Parvovirus porcino, virus de la Gastroenteritis Transmisible, rotavirus, Escherichia coli, Er y sipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Haemophilus parasuis y Streptococcus suis.

6. Un procedimiento de preparación de una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, comprendiendo dicho 15 procedimiento la mezcla de toxina ApxIV purificada con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. Un ensayo diagnóstico para distinguir la infección por Actinobacillus pleuropneumoniae en cerdos de la infección por A. suis en cerdos, caracterizado porque dicho ensayo comprende toxina ApxIV purificada.

8. Un procedimiento de detección de la presencia o ausencia de todos los serotipos de Actinobacillus pleuropneumoniae en cerdos que comprende las etapas de:

-proporcionar toxina ApxIV purificada, -proporcionar una muestra de un cerdo, en que la muestra es suero, -incubar la toxina ApxIV con la muestra, y -detectar la presencia o ausencia de anticuerpos contra la toxina ApxIV.

9. Un ensayo diagnóstico para distinguir entre cerdos infectados con cepas de campo de Actinobacillus pleuropneumoniae y cerdos vacunados con una vacuna que tiene una bacteria viva atenuada de la especie Actinobacillus pleuropneumoniae, en el que la vacuna no produce toxina ApxIV funcional, comprendiendo el ensayo toxina ApxIV purificada revestida sobre los pocillos de una placa de ELISA.

10. El ensayo de diagnóstico de la reivindicación 9 que comprende además un anticuerpo anti-cerdo marcado que puede revelar la presencia o ausencia de anticuerpos contra la toxina ApxIV.