Vacuna basada en polinucleótidos optimizados por codones contra infección por citomegalovirus humano.

Una composición que comprende un polinucleótido aislado que comprende la SEC ID Nº: 5.

Vacuna basada en polinucleótidos optimizados por codones contra infección por citomegalovirus humano Campo de la invención El citomegalovirus humano (“HCMV”) infecta entre 50% y 85% de adultos de 40 años (Gershon A. A., et al., in Viral Infections of Humans, Evans A.S. y Kaslow, R. A, eds., Plenum Press, Nueva York, NY (1997) ) . Aunque la infección por HCMV es benigna en la mayoría de los adultos sanos, puede dar como resultado neumonitis letal, así como colitis, esofagitis, leucopenia y retinitis en pacientes con trasplante y otros pacientes inmunocomprometidos, especialmente aquellos con VIH. En poblaciones de trasplante de órgano sólido (TOS) o trasplante de células hematopoyéticas (TCH) , la enfermedad por HCMV puede ocurrir a partir de nueva infección transmitida por el órgano donante o TCH, o puede recurrir como resultado de reactivación de virus latente en el receptor.

A pesar de las terapias autorizadas, la enfermedad asociada con HCMV permanece gravemente debilitante y con peligro para la vida en pacientes con VIH y los entornos TCH y TOS relacionados alogénicos. Además, el HCMV es la infección intrauterina más habitual en los Estados Unidos, y da como resultado la muerte o graves secuelas en más de 8.000 niños al año. Por estas razones, el HCMV se clasificó en la lista de las 10 vacunas más importantes que necesitan desarrollo en los Estados Unidos (Vaccines for the 21st centur y : a tool for decisión making, National Academy of Sciences (1999) ) .

Las terapias existentes incluyen el uso de inmunoglobulinas y agentes antivirales tales como ganciclovir y sus derivados, que son más eficaces cuando se usan profilácticamente o de manera muy precoz durante infección en poblaciones en riesgo. Sin embargo, estas terapias se caracterizan por una toxicidad significativa y eficacia limitada, especialmente para enfermedad de aparición tardía (aparece después de los primeros 100 días) (Fillet, A. M., DrugsAging 19: 343-354 (2002) ; von Bueltzingsloewen, A., et al, Bone Marrow Transplant 12: 197-202 (1993) ; Winston, D. J., et al, Ann. Intern. Mea 118: 179-184 (1993) ; Goodrich, J. M., et al., Anh. Intern. Med: 118: 173-178 (1993) ; Boeckh, M, et al., Blood 88: 4063-4071 (1996) ; Salzberger, B., et al, Blood 90: 2502-2508 (1997) ; Preiser, W., et al. J. Clin. Vírol. 20: 59-70 (2001) ; Grangeot-Keros, L., y Cointe, D, J. Clin. Virol. 21: 213-221 (2001) ; Boeckh, M., y Bowden, R., Cancer Treat. Res. 76: 97-136 (1995) ; Zaia J. A., et al, Hematology (Am. Soc. Hematol. Educ. Program) 339-355 (2000) ) .

Además de desarrollar diagnóstico más rápido y sensible, los métodos biológicos moleculares permiten el desarrollo de vacunas subunitarias definidas para patógenos humanos. De hecho, vacunas subunitarias recombinantes inocuas, eficaces, reducirían significativamente, y quizás eliminarían, la necesidad de tratamientos terapéuticos. En el caso del HCMV, el control de infección se ha correlacionado con anticuerpos y reconocimiento de linfocitos T de al menos tres proteínas virales: pp65, glucoproteína B (gB) y la proteína temprana-1 inmediata (IE1) .

La proteína viral pp65 de 65 kD, conocida también como ppUL83, proteína de matriz inferior, ICP27, PK68 y pp64, es una de las proteínas estructurales más abundantemente expresadas (Figura 1) . Está codificada por el gen UL83 del genoma viral (nucleótidos 119352-121037 de la secuencia genómica de la cepa AD169 del HCMV, Genbank X17403) . Se cree que esta proteína se procesa para la presentación de MCH poco después de la entrada viral en las células, lo que permite que se presente antes que otras proteínas virales inhabiliten la ruta de procesamiento antigénica en células infectadas. Por lo tanto, el reconocimiento de linfocitos T de esta proteína es importante para el control de la infección (Solache, et al. J. Immunol. 163: 5512-5518 (1999) ) .

La glucoproteína B (gB) es una glucoproteína de envoltura de 906 aminoácidos (Figura 4) codificada por UL55, nucleótidos 80772-83495 de Genbank X17403) . Se trata de una proteína de membrana integral de tipo I que participa en la fusión de la cubierta del virión con la membrana celular, es necesaria para la infectividad, es muy inmunogénica y tiene un alto grado de conservación entre las cepas HCMV, haciendo que esta proteína sea una diana atractiva para vacunas. La proteína de longitud completa contiene un péptido señal amino terminal (aminoácidos 1-24) , un dominio extracelular (aminoácidos 25-713) , un supuesto dominio de anclaje transmembrana (aminoácidos 714-771) y un domino intracelular (aminoácidos 772-906) . La deleción del dominio de anclaje transmembrana da como resultado la secreción de gB (Zheng et al J. Virol 70: 8029-8040 (1996) ) . Adicionalmente, la proteína de longitud completa se escinde por proteasas de furina hospedadora entre los aminoácidos 460 y 461 para formar productos de escisión gp93 y gp55 que permanecen fuertemente asociados como un heterodímero. (Mocarski E. S. y C. T. Courcelle, pág. 2629-2674, Field's Virology; 4ª ed., Eds. Knipe DM y Howley PM, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia (2001) ) .

IE1 es una proteína de 491 aminoácidos (Figura 7) codificada por UL123 ORF HCMV (Genbank X17403, nucleótidos 171006-172765) . El gen codifica un ARNm de 1, 9 Kb que comprende cuatro exones traduciéndose solamente los exones 2-4. Los 85 aminoácidos N-terminal se codifican por exones 2 y 3, codificándose el resto por el exón 4. IE2 es una familia de proteínas relacionada que comparten los exones 1-3 y un exón 5, con muchas variaciones de corte y empalme. Juntas, IE1 e IE2 transactivan el promotor temprano inmediato principal del HCMV para regular la transcripción viral (Malone, CL. et al. J. Virol 64: 1498-1506 (1990) ; Mocarski, E. Fields Virology Ed. Field et al, 3ra ed., págs. 2447-2491, Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia (1996) ; Chee M. S. et al, Curr Topics Microbiol Immunol. 154: 125-169 (1990) ) .

IE1 tiene una actividad quinasa que es dependiente de un sitio de unión al ATP codificado por los aminoácidos 173

196. IE1 puede autofosforilarse o fosforilar factores nucleares para transactivar transcripción dependiente de E2F. Ambos exones 3 y 4 son necesarios para la transactivación viral, con las regiones requeridas en el exón 4 ampliamente distribuidas a través del exón. Se sabe que la parte de la proteína codificada por el exón 4 tiene un alto grado de estructura secundaria. Aunque IE1 se transporta al núcleo, no se ha identificado señal de localización nuclear. (Pajovic, S. et al. Mol Cell. Bio. 17:6459-6464 (1997) ) . Gyulai et al. demostraron altos niveles de respuesta CTL in vitro contra células efectoras que expresan un fragmento nucleotídico que consiste en el exón 4 (Gyulai et al

J. Infectious Diseases 181: 1537-1546 (2000) ) .

Actualmente no se dispone de ninguna vacuna para la HCMV. Sin embargo, se han realizado ensayos clínicos con vacunas HCMV vivas atenuadas, una vacuna basada en el virus de la viruela del canario (canar y pox) y una vacuna gB recombinante (Plotkin, S. A., Pediatr. Infect. Dis. J. 18: 313-325 (1999) ) . La primera vacuna contra el HCMV ensayada en seres humanos era una vacuna de virus atenuado viva fabricada a partir de la cepa adaptada en laboratorio AD169 (Elek, S. D. y Stern, H., Lancet 1: 1-5 (1974) ) . Las reacciones locales eran comunes, pero el HCMV no se aisló de ninguno de los receptores de la vacuna. Esta vacuna no se investigó más allá de estudios en Fase I iniciales.

Se han determinado respuestas inmunitarias contra HCMV mediante el estudio de infecciones agudas y crónicas de HCMV en modelos animales y en seres humanos. Los anticuerpos parecen ser críticos en la prevención de transmisión fetomaterna y se dirigen principalmente a glicoproteínas de envoltura especialmente gB (Plotkin, S. A., Pediatr. Infect. Dis. J. 18: 313-325 (1999) ; Fowler, K. B., N. Engl. J. Med. 326: 663-667 (1992) ) .

Por otro lado, el control de infección por HCMV en receptores de trasplante y en personas infectadas por VIH está asociado con respuestas inmunitarias celulares preservadas, incluyendo linfocitos T CD4+, CD8+ y linfocitos citolíticos (NK) . Las respuestas de linfocitos T CD8+ se dirigen principalmente a la proteína temprana inmediata (IE) del HCMV y a la proteína pp65 tegumentaria abundante (Gyulai, Z., et al., J. Infect. Dis. 181: 1537-1546 (2000) ; Tabi, Z., et al., J. Immunol. 166: 5695-5703 (2001) ; Wills, M. R., et al., J. Virol. 70: 7569-7579 (1996) ; Frankenberg, N., et al, Virology 295: 208-216 (2002) ; Retiere, C, et al., J. Virol. 74: 3948-3952 (2000) ; Koszinowski, U. H., et al., J. Virol. 61: 2054-2058 (1987) ; Kern, F., et al., J. Infect. Dis. 185: 1709-1716 (2002) ) . Aproximadamente el 92% de las personas tienen respuestas... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende un polinucleótido aislado que comprende la SEC ID Nº: 5.

2. La composición de la reivindicación 1, que adicionalmente comprende un polinucleótido aislado que comprende la SEC ID Nº: 13.

3. La composición de la reivindicación 1 o 2, en la que la composición comprende un plásmido que comprende el polinucleótido aislado insertado en un vector de expresión eucariota, tal como VR10551, pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, pZeoSV2 y pCI.

4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que adicionalmente comprende un polinucleótido adicional que codifica un polipéptido HCMV, o fragmento inmunogénico del mismo, o un componente de vacuna de tipo convencional seleccionado del grupo que consiste en virus inactivados, virus atenuado, un vector viral que expresa un polipéptido HCMV aislado y un polipéptido aislado de una proteína viral HCMV, o fragmento inmunogénico del mismo.

5. La composición de la reivindicación 4, en la que dicho polinucleótido adicional comprende una región codificante optimizada por codones que codifica dicho polipéptido HCMV o fragmento inmunogénico del mismo.

6. La composición de la reivindicación 5, en la que dicho polipéptido HCMV es IE-1.

7. La composición de la reivindicación 6, en la que dicho polinucleótido adicional comprende la SEC ID Nº: 28.

8. La composición de la reivindicación 6, en la que la composición comprende un plásmido que comprende el polinucleótido adicional insertado en un vector de expresión eucariota, tal como VR10551, pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, pZeoSV2 y pCI.

9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende un componente seleccionado del grupo que consiste en un adyuvante y un compuesto facilitador de la transfección.

10. La composición de la reivindicación 9, en la que dicho adyuvante o dicho compuesto facilitador de la transfección se selecciona del grupo que consiste en: bromuro de (±) -N- (3-aminopropill) -N, N-dimetil-2, 3-bis (syn-9-tetradeceniloxi) -1-propanaminio (GAPDMORIE) y un lípido neutro; una citocina; monofosforil lípido A y trehalosadicorinomicolato AF (MPL+TDM) ; una formulación de monofosforil lípido A solubilizada; CRL1005/BAK; y bromuro de (±) -N- (2-hidroxietil) -N, N-dimetil-2, 3-bis (tetradeciloxi) -1-propanaminio (DMRIE) .

11. La composición de la reivindicación 9, en la que dicho adyuvante o dicho compuesto facilitador de la transfección comprende CRL 1005 y cloruro de benzalconio (BAK) .

12. La composición de la reivindicación 1, que adicionalmente comprende un adyuvante o un compuesto facilitador de la transfección que comprende CRL1005 y cloruro de benzalconio (BAK) , en la que dicho CRL1005 y BAK están presentes a concentraciones seleccionadas del grupo que consiste en: BAK 0, 3 mM y CRL 10057, 5 mg/ml, BAK 0, 3 mM y CRL 100534 mg/ml, y BAK 0, 3 mM y CRL 100550 mg/ml.

13. La composición de la reivindicación 12, que se formula combinando entre sí el CRL1005, BAK y un polinucleótido a una temperatura por debajo del punto de turbidez, sin ciclado térmico a una temperatura por encima del punto de turbidez.

14. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en un método para suscitar una respuesta inmunitaria contra CMV en un ser humano.

Figura 2 (continuación)

Figura 4 (continuación) Figura 4 (continuación) Figura 4 (continuación) Figura 4 (continuación)

Figura 5 (continuación) Figura 5 (continuación) Figura 5 (continuación)

Figura 6 (continuación) Figura 6 (continuación) Figura 6 (continuación) Figura 6 (continuación) Figura 6 (continuación) Figura 6 (continuación)