Uso terapéutico de microesferas de ácido nucleico.

Microesferas que comprenden entre un 20 por ciento en peso y un 100 por cien en peso de uno o más ácidosnucleicos y que tienen un tamaño de partícula medio no superior a aproximadamente 50 micrómetros,

estandodichas microesferas esencialmente libres de un polímero soluble utilizado en la preparación de lasmicroesferas, para su uso en terapia.

Uso terapéutico de microesferas de ácido nucleico Campo de la invención En general, la presente invención se refiere a la preparación de microesferas de ácidos nucleicos y a su administración, en particular para inducir tolerancia a las células dendríticas al abordar cuestiones médicas. Más particularmente, la invención se refiere a una tecnología de administración de fármacos por medio de microesferas fabricadas empleando condiciones acuosas. Las microesferas pueden incorporar ARN interferente, ADN plásmido, oligonucleótidos antisentido (AS) u otros ácidos nucleicos. Estas microesferas se utilizan para alterar funciones celulares in vivo e in situ.

Antecedentes de la invención Las micropartículas, microesferas y microcápsulas son partículas sólidas o semisólidas con un diámetro inferior a un milímetro, preferentemente inferior a 100 micras, que se pueden formar con diversos materiales, incluyendo polímeros sintéticos, proteínas y polisacáridos. Las microesferas se han utilizado en muchas aplicaciones diferentes, principalmente separaciones, diagnósticos y administración de fármacos.

Para la producción de estas microesferas a partir de polímeros sintéticos, polímeros naturales, proteínas y polisacáridos se pueden utilizar diversas técnicas diferentes, incluyendo separación de fases, evaporación de disolventes, emulsión y secado por pulverización. En general, los polímeros forman la estructura soporte de estas microesferas y el fármaco de interés se incorpora a la estructura polimérica. Ejemplos de polímeros utilizados para la formación de microesferas incluyen homopolímeros y copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico (PLGA) tal como los descritos en la Patente US nº 5.213.812, de Ruiz, Patente US nº 5.417.986, de Reid y col., Patente US nº 4.530.840, de Tice y col., Patente US nº 4.897.268, de Tice y col., Patente US nº 5.075.109, de Tice y col., Patente US nº 5.102.872, de Singh y col., Patente US nº 5.384.133, de Boyes y col., Patente US nº 5.360.610, de Tice y col., y la Publicación de Solicitud de Patente Europea Número 248.531, del Southern Research Institute; copolímeros en bloque tales como tetronic 908 y poloxámero 407 como los descritos en la Patente US nº 4.904.479, de Illum; y polifosfacenos tal como los descritos en la Patente US nº 5.149.543, de Cohen y col.. Las microesferas producidas utilizando tales polímeros muestran una baja eficiencia de carga y con frecuencia sólo pueden incorporar un pequeño porcentaje del fármaco de interés en la estructura polimérica. Por consiguiente, a menudo se deben administrar cantidades sustanciales de microesferas para lograr un efecto terapéutico.

Las perlas o partículas esféricas se han comercializado durante muchos años como una herramienta para los bioquímicos. Por ejemplo, los anticuerpos conjugados con perlas crean partículas relativamente grandes específicas para ligandos particulares. Las partículas grandes revestidas con anticuerpos se utilizan habitualmente para reticular receptores sobre la superficie de una célula para la activación celular, se unen a una fase sólida para la purificación de inmunoafinidad y pueden utilizarse para administrar un agente terapéutico que se libera lentamente con el tiempo utilizando anticuerpos de tejido o específicos de tumores conjugados con las partículas para dirigir el agente al lugar deseado.

Un método habitual para unir de forma covalente un anticuerpo a una matriz en fase sólida es derivar una perla con un agente de conjugación química y después unir el anticuerpo a la perla activada. El uso de una perla polimérica sintética en lugar de una molécula proteínica permite emplear unas condiciones de derivación mucho más rigurosas de lo que pueden admitir muchas proteínas, es relativamente económica y, con frecuencia, genera un enlace que es estable frente a una amplia gama de condiciones desnaturalizantes. Existe una serie de perlas derivadas comerciales, todas ellas con diversos constituyentes y tamaños. Existen perlas formadas a partir de polímeros sintéticos, tales como poliacrilamida, poliacrilato, poliestireno o látex, comercialmente disponibles de numerosas fuentes, como Bio-Rad Laboratories (Richmond, Calif.) y LKB Produkter (Estocolmo, Suecia) . También existen perlas formadas a partir de macromoléculas y partículas naturales, tales como agarosa, agarosa reticulada, globulina, ácido desoxirribonucleico y liposomas, comercialmente disponibles de fuentes tales como Bio-Rad Laboratories, Pharmacia (Piscataway, N. J.) e IBF (Francia) . Existen perlas formadas a partir de copolímeros de poliacrilamida y agarosa comercialmente disponibles de fuentes tales como IBF y Pharmacia. Existen perlas magnéticas comercialmente disponibles de fuentes tales como Dynal Inc. (Great Neck, N. Y.) .

Una desventaja de las micropartículas o perlas actualmente disponibles es que son difíciles y costosas de producir. La micropartículas producidas por estos métodos conocidos tienen una amplia distribución de tamaño de partícula, frecuentemente carecen de uniformidad y no tienen una cinética de liberación a largo plazo cuando la concentración de los principios activos es alta. Además, los polímeros utilizados en estos métodos conocidos se disuelven en disolventes orgánicos para formar las micropartículas. Por consiguiente, se deben producir en instalaciones especiales diseñadas para manipular disolventes orgánicos. Estos disolventes orgánicos podrían desnaturalizar las proteínas o péptidos contenidos en las micropartículas. Los disolventes orgánicos residuales podrían ser tóxicos al ser administrados a humanos o animales.

Además, las micropartículas disponibles casi nunca tienen un tamaño lo suficientemente pequeño para caber a través de la abertura del tamaño de la aguja habitualmente utilizada para administrar agentes terapéuticos o como para ser útiles en una administración vía inhalatoria. Por ejemplo, las micropartículas preparadas utilizando ácido glicólicopoliláctico (PLGA) son grandes y tienen tendencia a agregarse. Es necesario un paso de selección por tamaño, que conduce a una pérdida de producción, para eliminar aquellas partículas demasiado grandes para la inyección. Las partículas de PLGA de tamaño adecuado para la inyección deben ser administradas a través de una aguja de gran calibre para alojar estas grandes partículas, lo que frecuentemente produce molestias al paciente.

En general, muchas de las micropartículas actualmente disponibles se activan para liberar sus contenidos en medios acuosos y, por tanto, deben liofilizarse para evitar una liberación prematura. Además, aquellas partículas tales como las preparadas utilizando el sistema PLGA tienen una cinética de liberación basada tanto en la erosión como en la difusión. En este tipo de sistema se observa una descarga inicial o liberación rápida del fármaco. Este efecto de descarga rápida puede dar lugar a efectos secundarios no deseados en los pacientes a los que se les han administrado las partículas.

También se conocen micropartículas preparadas utilizando lípidos para encapsular fármacos diana. Por ejemplo, se pueden utilizar lípidos dispuestos en membranas bicapa que rodean múltiples compartimentos acuosos para formar partículas a utilizar en la encapsulación de fármacos solubles en agua para su administración posterior, tal como se describe en la Patente US nº 5.422.120, de Sinil Kim. En general, estas partículas tienen tamaños superiores a 10 micrómetros y están diseñadas para la administración intraarticular, intratecal, subcutánea y epidural. Alternativamente también se utilizan liposomas para la administración intravenosa de moléculas pequeñas. Los liposomas son partículas esféricas compuestas por un fosfolípido simple o múltiple y bicapas de colesterol. Los liposomas tienen un tamaño de 30 micrómetros o más y pueden portar diversos fármacos solubles en agua o en lípidos. La tecnología de liposomas se ha visto obstaculizada por varios problemas, incluyendo la pureza de los componentes lipídicos, la posible toxicidad, la heterogeneidad y estabilidad vesicular, la absorción excesiva y las dificultades de fabricación y vida útil en almacenamiento.

Un objetivo para la comunidad médica es suministrar ácidos nucleicos en las células de un sujeto, incluyendo, de forma no exclusiva, un animal o mamífero, para tratarlo. Por ejemplo, es posible suministrar ácidos nucleicos a células en cultivo (in vitro) de forma relativamente eficaz, pero las nucleasas conducen a una alta tasa de degradación del ácido nucleico cuando éste se administra a animales (in vivo) .

Además de proteger el ácido nucleico frente a la digestión por nucleasa, el vehículo de suministro del ácido nucleico... [Seguir leyendo]

1. Microesferas que comprenden entre un 20 por ciento en peso y un 100 por cien en peso de uno o más ácidos nucleicos y que tienen un tamaño de partícula medio no superior a aproximadamente 50 micrómetros, estando dichas microesferas esencialmente libres de un polímero soluble utilizado en la preparación de las microesferas, para su uso en terapia.

2. Microesferas según la reivindicación 1, caracterizadas porque dichos ácidos nucleicos constituyen entre un 30 por ciento en peso y un 100 por cien en peso de las microesferas.

3. Microesferas según la reivindicación 1, caracterizadas porque dichos ácidos nucleicos constituyen entre un 50 por ciento en peso y un 100 por cien en peso de las microesferas.

4. Microesferas según la reivindicación 1, caracterizadas porque dichos ácidos nucleicos constituyen entre un 70 por ciento en peso y un 100 por cien en peso de las microesferas.

5. Microesferas según la reivindicación 1, caracterizadas porque dichos ácidos nucleicos constituyen entre un 90 por ciento en peso y un 100 por cien en peso de las microesferas.

6. Microesferas según la reivindicación 1, en las que dichos ácidos nucleicos constituyen al menos aproximadamente un 95 por ciento en peso de las microesferas.

7. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque contienen al menos dos ácidos nucleicos diferentes.

8. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque al menos uno de los ácidos nucleicos es un oligonucleótido.

9. Microesferas según la reivindicación 8, caracterizadas porque al menos dos oligonucleótidos diferentes.

10. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque tienen un tamaño de partícula medio no superior a aproximadamente 2 micrómetros y una distribución de tamaño de partículas entre aproximadamente 0, 04 micrómetros y aproximadamente 8 micrómetros.

11. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque tienen un tamaño de partícula medio no superior a aproximadamente 1 micrómetro y una distribución de tamaño de partículas entre 0, 2 micrómetros y 4 micrómetros.

12. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque dichos ácidos nucleicos se seleccionan entre el grupo consistente en ADN, oligonucleótidos de ADN, oligorribonucleótidos de ARN, oligonucleótidos híbridos de ADN/ARN, ARNm, ARNsi, o ARNt, y combinaciones de los mismos.

13. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque están en suspensión.

14. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque están en una formulación en polvo seco.

15. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque son adecuadas para la administración vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, tópica, intradérmica, intraperitoneal, oral, pulmonar, ocular, nasal, bucal, vaginal y/o rectal.

16. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque son adecuadas para la inyección subcutánea.

17. Proceso acuoso para producir microesferas biológicamente activas que comprenden ácidos nucleicos, comprendiendo el proceso (a) disolver los ácidos nucleicos con un disolvente acuoso para formar una composición acuosa, añadiéndose al menos un polímero soluble en agua al disolvente acuoso, y (b) formar microesferas que comprenden ácidos nucleicos, teniendo dichas microesferas un tamaño de partícula medio no superior a aproximadamente 50 micrómetros y estando éstas esencialmente libres de dicho polímero.

18. Proceso según la reivindicación 17, caracterizado porque la formación se lleva a cabo por enfriamiento de la composición.

19. Proceso según la reivindicación 18, caracterizado porque la composición se enfría a una temperatura entre aproximadamente 35ºC y aproximadamente -196ºC.

20. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 17-19, caracterizado porque la formación se lleva a cabo en ausencia de un componente de policatión en la composición.

21. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 17-20, caracterizado porque

a) la formación se lleva a cabo en ausencia de un componente reticulante en dicha composición;

b) los ácidos nucleicos son un primer polianión y la formación se lleva a cabo en ausencia de un segundo componente de polianión en la composición; o c) la disolución se lleva a cabo en ausencia de aplicación de una fuente de energía para formar las microesferas a partir de la composición.

22. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 17-19, caracterizado porque se añade al menos un policatión al disolvente.

23. Proceso según la reivindicación 22, caracterizado porque el policatión es polilisina o poliornitina.

24. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 17-19, 22 y 23, caracterizado porque

a) la formación se lleva a cabo con la adición de un agente reticulante a la composición; b) los ácidos nucleicos son un primer polianión, y al menos un segundo polianión se añade al disolvente; o c) la disolución se lleva a cabo con adición de energía a la composición.

25. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 17-24, caracterizado porque los ácidos nucleicos constituyen al menos un 20 por ciento en peso de las microesferas formadas por el proceso.

26. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 17-24, caracterizado porque los ácidos nucleicos constituyen al menos un 50 por ciento en peso de las microesferas formadas por el proceso.

27. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 17-24, caracterizado porque los ácidos nucleicos constituyen al menos un 90 por ciento en peso de las microesferas formadas por el proceso.

28. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 17-27, caracterizado porque el tamaño de partícula medio de las microesferas oscila entre 0, 04 y 5 micrómetros.

29. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 17-27, caracterizado porque el tamaño de partícula medio de las microesferas oscila entre aproximadamente 1 micrómetro y aproximadamente 3 micrómetros.

30. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 17-30, caracterizado porque las microesferas están formadas por ácidos nucleicos amorfos o semicristalinos.

31. Proceso según cualquiera de las reivindicacione.

2. 30, caracterizado porque la relación volumétrica policatión:ácido nucleico en la composición oscila entre aproximadamente 0, 5:1 y aproximadamente 4:1.