Uso de ornitina transcarbamilasa (OTC) como marcador para el diagnóstico de daños cerebrales.

Un procedimiento para el diagnóstico in vitro de una alteración cerebral seleccionada del grupo constituidopor deterioro cognitivo leve,

demencia por enfermedad de Alzheimer y demencia sin enfermedad de Alzheimer en unindividuo, que comprende la etapa de detectar ornitina transcarbamilasa (OTC) en una muestra de líquidocefalorraquídeo de dicho individuo, en el que la presencia de ornitina transcarbamilasa en el líquido cefalorraquídeoes indicativa de enfermedad cerebral.

Uso de ornitina transcarbamilasa (OTC) como marcador para el diagnóstico de daños cerebrales La presente invención pertenece al campo de las enfermedades cerebrales, y proporciona marcadores y procedimientos novedosos para diagnosticar una alteración cerebral en un individuo, especialmente en pacientes que padecen enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer. La presente invención proporciona también herramientas para evaluar la probabilidad de que un individuo desarrolle la enfermedad, así como una diana para identificar nuevos fármacos para tratar enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa multifactorial compleja y una causa importante de demencia entre los ancianos. Aproximadamente un 5 % de las personas de 65 años o más están afectadas por la EA y la prevalencia aumenta abruptamente a 19 % después de los 75 años y a 47 % después de los 85. Actualmente, existen más de 4 millones de casos de EA en los EE.UU., 850.000 en Francia y 12-14 millones en todo el mundo. El grupo de 85 años y más, en que casi un 50 % está afectado por alguna forma de demencia, es uno de los segmentos de más rápido crecimiento de las poblaciones europeas y estadounidense. Sin embargo, la modelización sugiere que un retraso de 5 años podría reducir la prevalencia de demencia un 50 %, permitiendo un control potencial de esta dramática pandemia. Dicha posibilidad plantea dos temas esenciales: (i) diagnóstico temprano y (ii) eficacia de la terapia.

Hasta la fecha, aunque se han realizado importantes mejoras, sigue siendo difícil asignar un diagnóstico en la etapa muy temprana de la enfermedad. Además, no existe un tratamiento curativo, aunque están disponibles algunos tratamientos sintomáticos de las funciones cognitivas, principalmente inhibidores de acetilcolinesterasa (3 moléculas actualmente registradas) y, más recientemente, un antagonista del receptor de NMDA. Sin embargo, todo este arsenal terapéutico, cuando los pacientes pueden beneficiarse del mismo, permite como máximo un retraso en la inevitable dependencia resultante del agravamiento de la enfermedad.

Como consecuencia, el diagnóstico temprano y el arsenal terapéutico están estrechamente ligados. Para proponer un tratamiento eficaz, parece esencial establecer un diagnóstico en la etapa más temprana de la enfermedad, o incluso detectar los primeros signos de la patología a nivel subclínico.

En los sujetos que se hacen mayores, se observan habitualmente síntomas de falta de memoria y cognitivos, pero no están necesariamente asociados a un declive cognitivo patológico. Estos síntomas pueden ser un simple indicador de un problema aislado y menor o, por el contrario, indicar una alteración cognitiva y patológica objetiva. Dentro de este marco, se ha propuesto el concepto de “deterioro cognitivo leve” o DCL para caracterizar a los sujetos localizados en la zona de transición entre el envejecimiento normal y la demencia. Estos pacientes presentan un declive objetivo de sus rendimientos cognitivos sin satisfacer los criterios clínicos de demencia. El índice de conversión de estos pacientes es de aproximadamente 14 % al año, y un 50 % de los casos de DCL habrá desarrollado demencia tres años después. Muy pocos trabajos permiten tener una visión a largo plazo, pero una parte no despreciable de estos casos de DCL no desarrollará demencia (aproximadamente un 20 %) 5 años después.

A pesar de su frecuencia, la base genética molecular de las enfermedades neurodegenerativas no está clara. Respecto a la enfermedad de Alzheimer, está establecido que existen dos tipos de EA: (i) EA familiar (EAF) , que cursa en familias, y (ii) EA esporádica, en que no está presente un historial familiar obvio. Las formas de inicio temprano familiares de EA dan cuenta de menos de un 5 % del número total de casos, y estas se han ligado a mutaciones en tres genes diferentes: el gen de proteína precursora amiloide (APP) en el cromosoma 21, el gen de presenilina 1 (PS1) en el cromosoma 14 y el gen de presenilina 2 (PS2) en el cromosoma 1 (Cruts y Van Broeckhoven, 1998) . La etiología de la EA esporádica de inicio tardío es más compleja, con la posible implicación, e interacción entre ellos, de factores ambientales y numerosos genes. La apolipoproteína E (APOE) , especialmente el alelo e4 de APOE, se ha establecido como un fuerte marcador de la propensión que da cuenta de aproximadamente un 20 % del riesgo genético en EA de inicio tardío (Kamboh, 2004) . Sin embargo, como el alelo s4 de APOE no es necesario ni suficiente por sí solo para el desarrollo de EA, es probable que otros factores genéticos y/o ambientales, que actúan solos o junto con £4 de APOE, puedan modificar el riesgo de EA. Recientemente, estudios de ligamiento del genoma completo o desequilibrio de ligamiento (DL) sobre EA de inicio tardío han proporcionado pruebas de la existencia de múltiples presuntos genes para EA en varios cromosomas. Sin embargo, la localizacion general de los presuntos genes de EA en un cromosoma dado cubre una amplia región. Además, una de estas regiones puede contener también varios genes de interés. Por lo tanto, no está claro si estos descubrimientos indican la existencia de múltiples genes en un cromosoma, o si representan una variación casual dentro de la región de interés, porque las estimaciones de localización de genes basada en estudios de ligamiento pueden variar en 30 cM o más para trastornos complejos (Roberts et al., 1999) .

Para priorizar la selección de genes candidatos localizados en estas regiones de interés, un procedimiento apropiado y consistente sería combinar los datos de información del mapa genético con los datos de perfil de expresión génica para una identificación rápida de los genes. Esta suposición surge de dos observaciones importantes:

(i) la expresión de numerosos genes se modifica durante la etiología de EA (Blalock et al., 2004; Brown et al., 2002; Colangelo et al., 2002; Li et al., 2003; Loring et al., 2001) ;

(ii) así como variaciones cualitativas (concretamente, mutaciones de codificación) en genes ya implicados en la EA y variaciones cuantitativas en la expresión de estos mismos genes se ha mostrado también que son determinantes genéticos de la enfermedad. Por ejemplo, los polimorfismos funcionales en las secuencias promotoras de genes APOE, PS1 y PS2 se han asociado a un riesgo aumentado de desarrollo de EA (Lambert et al., 2002; Riazanskaia et al., 2002; Theuns et al., 2000) . Se ha discutido una implicación similar de APP (Lahiri et al., 2005) .

Por consiguiente, lo inventores plantearon la hipótesis de que los genes que exhiben una expresión diferencial entre pacientes y controles, y localizados en una de las regiones de interés definidas por barridos genómicos anteriores, podrían constituir genes candidatos potenciales para EA. Para desarrollar el enfoque de “convergencia genómica”, desarrollaron una micromatriz casera para cribar 2741 marcos abiertos de lectura (ORF) contenidos en los loci asociados al riesgo (en nueve cromosomas diferentes) identificados anteriormente en estudios de barrido genómico (Lambert et al., 2003) . Este perfil de expresión de tejidos cerebrales en 12 controles y 12 pacientes con EA les conduce a seleccionar 106 genes expresados diferencialmente. Entre estos 106 genes modulados, 11 se localizaban en el cromosoma X.

Sorprendentemente, los inventores encontraron que uno de estos genes se sobreexpresa en gran medida en el cerebro de casos de EA, mientras que no se expresa en el cerebro de los controles. Este gen es el gen de ornitina transcarbamilasa (OTC) localizado en Xp21.1. La OTC es una enzima clave del ciclo de la urea que no es funcional en el “cerebro normal” (Felipo y Butterworth, 2002; Wiesinger, 2001) .

En sujetos sanos, la OTC se expresa casi exclusivamente en mitocondrias hepatocelulares y se considera como un marcador específico del hígado. Se ha mostrado que el nivel sérico de esta proteína aumentaba en pacientes con trastornos hepáticos como hepatitis, cirrosis y cáncer. Aunque no se expresa en el cerebro de sujetos sanos, la deficiencia de esta enzima puede conducir a trastornos neurológicos. Es más, uno de los síntomas habituales de deficiencia de ornitina transcarbamilasa (que es muy heterogénea en su presentación) es el coma hiperamoniémico (Gordon, 2003) .

Los inventores estudiaron extensamente el gen de OTC en individuos con EA y de control. También estudiaron el nivel de actividad de OTC presente en el líquido cefalorraquídeo de sujetos que padecen DCL, demencia con EA y sin EA y sus resultados, dados a conocer en la parte experimental a continuación, demuestran... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para el diagnóstico in vitro de una alteración cerebral seleccionada del grupo constituido por deterioro cognitivo leve, demencia por enfermedad de Alzheimer y demencia sin enfermedad de Alzheimer en un individuo, que comprende la etapa de detectar ornitina transcarbamilasa (OTC) en una muestra de líquido cefalorraquídeo de dicho individuo, en el que la presencia de ornitina transcarbamilasa en el líquido cefalorraquídeo es indicativa de enfermedad cerebral.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la detección de ornitina transcarbamilasa (OTC) en dicha muestra de líquido cefalorraquídeo se efectúa detectando la actividad de OTC.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la actividad de OTC se detecta y cuantifica midiendo la 10 producción de citrulina después de la adición de fosfato de carbamilo y ornitina a dicha muestra.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la detección de ornitina transcarbamilasa (OTC) de dicha muestra de líquido cefalorraquídeo se efectúa mediante inmunoensayo con un anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra OTC.

5. Un procedimiento para diagnosticar una alteración cerebral seleccionada del grupo constituido por deterioro

cognitivo leve, demencia por enfermedad de Alzheimer y sin enfermedad de Alzheimer en un individuo fallecido, que comprende la etapa de marcar una biopsia cerebral de dicho individuo con un anticuerpo anti-OTC, en el que la presencia de ornitina transcarbamilasa en las células endoteliales cerebrovasculares es indicativa de una alteración cerebral.

6. El procedimiento de la reivindicación 4 o el procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho anticuerpo 20 es un anticuerpo monoclonal o policlonal obtenido contra un polipéptido específico de OTC humana.

7. El procedimiento según la reivindicación 5 o 6, en el que la presencia de ornitina transcarbamilasa en células endoteliales cerebrovasculares es indicativa de enfermedad de Alzheimer.

8. Uso de un anticuerpo dirigido contra ornitina transcarbamilasa humana para el diagnóstico in vitro de una enfermedad cerebral seleccionada del grupo constituido por deterioro cognitivo leve, demencia por enfermedad de

Alzheimer y sin enfermedad de Alzheimer, en el que dicho anticuerpo se usa en un inmunoensayo en una muestra de líquido cefalorraquídeo.