Tratamiento y prevención de la enfermedad intestinal inflamatoria que implica IL-13 y células NKT.

Una sustancia que inhibe la unión de la IL-13 a los receptores de IL-13 sobre células NKT para usar en eltratamiento o la prevención de la respuesta inflamatoria en la enfermedad intestinal inflamatoria,

en donde laenfermedad intestinal inflamatoria comprende enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, o en donde la enfermedadintestinal inflamatoria produce fibrosis en un sujeto, en donde la sustancia comprende una IL-13 mutante o unácido nucleico aislado que codifica una IL-13 mutante, en donde la una IL-13 mutante comprende una mutaciónque consiste en la sustitución de un residuo de ácido glutámico en la posición 13 de la IL-13 por un residuo deaminoácido cargado positivamente o neutro, y en donde la IL-13 mutante está unida a una molécula efectora, endonde la molécula efectora es una citotoxica o un radionúclido.

Tratamiento y prevención de la enfermedad intestinal inflamatoria que implica IL-13 y células NKT

Antecedentes de la invención La enfermedad intestinal inflamatoria (EII) incluye la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. La colitis ulcerosa es una enfermedad del colon o del intestino grueso. La enfermedad está marcada por inflamación y ulceración de la mucosa del colon, en revestimiento más interno. La inflamación suele comenzar en el recto y la parte inferior del colon, pero también puede afectar a todo el colon, extendiéndose hacia arriba del colon de un modo continuo. Por el contrario, la enfermedad de Crohn puede afectar a cualquier zona del tracto gastrointestinal, incluido el intestino delgado y el colon, generalmente no es continua y puede afectar a todo el espesor de la pared intestinal.

Se cree que tanto la enfermedad de Crohn como la colitis ulcerosa se deben a una sensibilidad anómala de los linfocitos T en la mucosa frente a los antígenos bacterianos en la luz intestinal ( (Sartor, 1995) . En personas con EII, el sistema inmunitario reacciona de forma inadecuada, confundiendo alimentos, bacterias y otros materiales del intestino con sustancias extrañas o invasoras. En el proceso, el cuerpo envía glóbulos blancos al revestimiento de los intestinos, donde producen inflamación crónica, Estas células generan productos dañinos que en última instancia conducen a úlceras y lesión intestinal. Cuando esto sucede, el paciente experimenta los síntomas de EII.

Se estima que ya un millón de americanos tiene EII, con una cifra que se reparte de forma uniforme entre la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. Actualmente no existe una curación médica para la EII, no obstante los tratamientos médicos actuales están dirigidos a suprimir la inflamación anómala en el revestimiento del colon y, de este modo, a controlar los síntomas. Las principales clases de medicación que se usan actualmente para tratar la EII incluyen aminosalicilatos, corticosteroides y medicamentos inmunomoduladores. No obstante, los aminosalicilatos son eficaces únicamente en el tratamiento de episodios leves o moderados de colitis ulcerosa, no se recomienda el uso prolongado de esteroides debido a los efectos secundarios y las actuales medicaciones inmunomoduladoras (p. ej., azatioprina, 6-mercaptopurina y metotrexato) pueden necesitar hasta tres meses antes de que comiencen a producir efectos beneficiosos. Por tanto, se necesitan nuevos y mejores tratamientos para tratar y prevenir los síntomas de la EII.

Sumario de la invención En el presente documento se proporciona una sustancia que inhibe la unión de la IL-13 a los receptores de IL-13 sobre las células NKT para usar en el tratamiento o prevención de la respuesta inflamatoria en la enfermedad intestinal inflamatoria, en el que la enfermedad intestinal inflamatoria comprende enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, o en el que la enfermedad intestinal inflamatoria produce fibrosis en un sujeto, en el que la sustancia comprende una IL-13 mutante o un ácido nucleico aislado que codifica una IL-13 mutante, en el que la una IL-13 mutante comprende una mutación que consiste en la sustitución de un residuo de ácido glutámico en la posición 14 de la IL-13 por un residuo de aminoácido cargado positivamente o neutro, y en el que la IL-13 mutante está unida a una molécula efectora, en la que la molécula efectora es una citotoxina o un radionúclido.

También se proporciona el uso de una sustancia que inhibe la unión de la IL-13 a los receptores de IL-13 sobre las células NKT para preparar un medicamento para el tratamiento o la prevención de la respuesta inflamatoria en la enfermedad intestinal inflamatoria, en el que la enfermedad intestinal inflamatoria comprende enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, o en el que la enfermedad intestinal inflamatoria produce fibrosis en un sujeto, en el que el compuesto comprende una IL-13 mutante o un ácido nucleico aislado que codifica una IL-13 mutante, en el que la una IL-13 mutante comprende una mutación que consiste en la sustitución de un residuo de ácido glutámico en la posición 14 de la IL-13 por un residuo de aminoácido cargado positivamente o neutro, y en el que la IL-13 mutante está unida a una molécula efectora, en la que la molécula efectora es una citotoxina o un radionúclido.

Breve descripción de las figuras

Las figuras adjuntas, que se incorporan y constituyen una parte de esta memoria, ilustran varias formas de realización de la invención y, junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención.

Las Figuras 1A -F muestran que la sensibilización previa antes de la exposición intrarrectal a oxazolona conduce a una colitis progresiva crónica. Las Figuras 1A y 1B muestran la pérdida de peso y la mortalidad, respectivamente, de los ratones después de la sensibilización previa con vehículo (etanol) o con oxazolona y la exposición intrarrectal con vehículo o diferentes dosis de oxazolona. Las Figuras C y E muestran aumentos por 5 y por 10, respectivamente, de secciones transversales teñidas con H-E de colon de ratones 7 días después de la sensibilización previa con etanol y la exposición. Las Figuras 1D y 1F muestran los efectos tras la sensibilización previa con oxazolona y la reexposición a un 1 % de oxazolona por vía intrarrectal.

Las Figuras 2A -B muestran la producción de citocina por los linfocitos de ratones con colitis por oxazolona. (A) Células mononucleares de la lámina propia (LPMC) , Células mononucleares hepáticas (HMNC) , células de los ganglios linfáticos mesentéricos (MLNC) y esplenocitos (SPC) se aislaron el día 5 tras la inducción de colitis por oxazolona (gris) o colitis por TNBS aguda (negro) y se estimularon in vitro durante 48 horas con anti-CD3 y anti-CD28 unidos a la placa. Las concentraciones de las citocinas se midieron en los sobrenadantes mediante ELISA. (B)

LPMC se aislaron los días 2, 5 u 8 tras la inducción de colitis por oxazolona. Las LPMC se estimularon como se ha indicado anteriormente y se midieron las concentraciones de IL-4 (abiertos) e IL-13 (rayados) en los sobrenadantes. Las LPMC, MLNC, o SPC producen una cantidad muy pequeña de IL-13 en el modelo agudo de colitis inducida por TMBS. No obstante, como se ha descrito anteriormente se observa una producción mucho mayor de IL-13 en un modelo crónico de TNBS en ratones BALB/c.

Las Figuras 3A-B muestran que la neutralización de la IL-13 previene la inducción de la colitis por oxazolona. (A) Pérdida de peso y (B) mortalidad de ratones con colitis por oxazolona tratada con IL-13Rα2-Fc (rombos) o proteína control (cuadrados) .

Las Figuras 4A-D muestran que el agotamiento de los linfocitos NK1.1 protege a los ratones de la colitis por oxazolona pero no de la colitis por TNSB. Pérdida de peso (A+C) y mortalidad (B+D) tras la inducción de colitis por oxazolona (A+B) o colitis por TNSB (C+D) o inyección de vehículo (etanol; círculos) . Se inyectó a los ratones anticuerpo control (cuadrados) o con agotamiento de células NK1.1 con PK136 (rombos) .

Las Figuras 5A-B muestran la presentación de antígenos a CD1 y que las células NKT para Jα281 son esenciales para la inducción de colitis con oxazolona. (A) Pérdida de peso de los ratones tras la inyección intrarrectal de vehículo (círculos) u oxazolona tras la inyección i.v. de anticuerpos CD1 de bloqueo (20H2; rombos) o anticuerpo control (cuadrados) . (B) Pérdida de peso de ratones CD1KO tras la inducción de colitis con oxazolona (rombos) , ratones Jα281KO (círculos) y ratones de tipo silvestre (cuadrados) .

La Figura 6 muestra la producción de citocinas en respuesta a αGalCer. LPMC (panel superior) , esplenocitos o células CD4 (panel inferior) no estimuladas (sin estim.) o estimuladas con anti-CD3 unido a la placa y anti-CD28 soluble, células L no transfectadas y vehículo (LC+Veh.) , o células L transfectadas con CD1 y 100 ng/ml de αGalCer (LCD1+aGC) .

La Figura 7 muestra un gráfico del peso de los ratones con colitis por oxazolona tratados con una toxina de IL-13 de pseudomonas (IL13PE38) .

La Figura 8 muestra una curva del peso de ratones Balb/c que recibieron administración intrarrectal de TNBS.

La Figura 9 muestra la cuantificación de colágeno en muestras de colon. La inflamación intestinal crónica se establece y se observa aumento de la cantidad de formación de colágeno. La formación de colágeno coincide con la aparición de fibrosis.

La Figura 10 muestra la medición de citocinas obtenidas según una base semanal de tejido de colon de ratones Balb/c sometidos a administración seminal de TNBS. Inicialmente se encontró una respuesta mediada por Th1 (aumento de IL-12 e IFN-gamma) . No obstante,... [Seguir leyendo]

1. Una sustancia que inhibe la unión de la IL-13 a los receptores de IL-13 sobre células NKT para usar en el tratamiento o la prevención de la respuesta inflamatoria en la enfermedad intestinal inflamatoria, en donde la 5 enfermedad intestinal inflamatoria comprende enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, o en donde la enfermedad intestinal inflamatoria produce fibrosis en un sujeto, en donde la sustancia comprende una IL-13 mutante o un ácido nucleico aislado que codifica una IL-13 mutante, en donde la una IL-13 mutante comprende una mutación que consiste en la sustitución de un residuo de ácido glutámico en la posición 13 de la IL-13 por un residuo de aminoácido cargado positivamente o neutro, y en donde la IL-13 mutante está unida a una molécula efectora, en donde la molécula efectora es una citotoxica o un radionúclido.

2. La sustancia que inhibe la unión de IL-13 a los receptores de IL-13 en células NKT para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la IL-13 mutante es una IL-13 humana mutante que se une al receptor de IL-13 pero que tiene una capacidad reducida para activar la señalización en dicho receptor

3. La sustancia que inhibe la unión de IL-13 a los receptores de IL-13 en células NKT para usar de acuerdo con la 15 reivindicación 2, en la que la IL-13 mutante tiene una mayor afinidad por el receptor de IL-13 que la IL-13 humana.

4. La sustancia que inhibe la unión de IL-13 a los receptores de IL-13 en células NKT para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el residuo cargado negativamente en la posición 13 de la IL-13 está sustituido por un residuo seleccionado de lisina y arginina.

5. La sustancia que inhibe la unión de IL-13 a los receptores de IL-13 en células NKT para usar de acuerdo con la 20 reivindicación 1, en la que la IL-13 mutante comprende la mutación hIL-13E13K de la SEC ID Nº 8.

6. La sustancia que inhibe la unión de IL-13 a los receptores de IL-13 en células NKT para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la IL-13 unida a una molécula efectora es una proteína de fusión.

7. La sustancia que inhibe la unión de IL-13 a los receptores de IL-13 en células NKT para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la molécula efectora está conjugada con la IL-13 mutante.

8. La sustancia que inhibe la unión de IL-13 a los receptores de IL-13 en células NKT para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la citotoxina se selecciona de exotoxina de Pseudomonas o una subunidad citotóxica o mutante de la misma, la toxina diftérica o una subunidad citotóxica o mutante de la misma, ricina, saporina, gelonina, caliqueamicina, doxorrubicina, ribotoxina, proteína inactivadora del ribosoma y abrina.

9. La sustancia que inhibe la unión de IL-13 a los receptores de IL-13 en células NKT para usar de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la exotoxina de Pseudomonas se selecciona de PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE38QQR.

10. La sustancia que inhibe la unión de IL-13 a los receptores de IL-13 en células NKT para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el ácido nucleico es un vector.

11. Uso de una sustancia que inhibe la unión de la IL-13 a los receptores de IL-13 sobre células NKT para preparar

un medicamento para el tratamiento o la prevención de la respuesta inflamatoria en la enfermedad intestinal inflamatoria, en donde la enfermedad intestinal inflamatoria comprende enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, o en donde la enfermedad intestinal inflamatoria produce fibrosis en un sujeto, en donde el compuesto comprende una IL-13 mutante o un ácido nucleico aislado que codifica una IL-13 mutante, en donde la IL-13 mutante comprende una mutación que consiste en la sustitución de un residuo de ácido glutámico en la posición 13 de la IL-13 por un residuo de aminoácido cargado positivamente o neutro, y en donde la IL-13 mutante está unida a una molécula efectora, en donde la molécula efectora es una citotoxina o un radionúclido.

12. El uso de la reivindicación 11, en el que la IL-13 mutante es una IL-13 mutante humana que se une al receptor de IL-13 pero que tiene menor capacidad para activar la señalización en dicho receptor.

13. El uso de la reivindicación 11, en el que la IL-13 mutante tiene una afinidad mayor por el receptor de IL-13 que la 45 IL-13 humana.

14. El uso de la reivindicación 11, en el que el residuo cargado negativamente en la posición 13 de la IL-13 está sustituido por un residuo seleccionado de lisina y arginina.

15. El uso de la reivindicación 11, en el que la IL-13 mutante comprende la mutación hIL-13E13K de la SEC ID Nº 8.

16. El uso de la reivindicación 11, en el que la IL-13 unida a una molécula efectora es una proteína de fusión.

17. El uso de la reivindicación 11, en el que la molécula efectora está conjugada a la IL-13 mutante.

18. El uso de la reivindicación 11, en el que la citotoxina se selecciona de exotoxina de Pseudomonas o de una subunidad citotóxica o mutante de la misma, toxina diftérica o una subunidad citotóxica o mutante de la misma,

ricina, saporina, gelonina, caliqueamicina, doxorrubicina, ribotoxina, proteína inactivadora del ribosoma y abrina.

19. El uso de la reivindicación 18, en el que la exotoxina de Pseudomonas se selecciona de PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE38QQR.

20. El uso de la reivindicación 11, en el que el ácido nucleico es un vector.

21. Un procedimiento ex vivo para proporcionar específicamente una molécula efectora a una célula NKT, que comprende unir la molécula efectora a una molécula de unión al receptor de IL-13 (IL13RBM) y proporcionar a la célula una cantidad eficaz de la molécula efectora unida a IL13RBM.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que IL13RBM es una IL-13 humana mutante.

23. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que el efector unido a IL13RBM es una proteína de fusión. 10 24. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que la molécula efectora está conjugada a IL13RBM.

25. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que la molécula efectora inhibe la actividad de la célula NKT.

26. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que la molécula efectora se selecciona de una citotoxina, un marcador, un radionúclidos, un fármaco, un liposoma y un anticuerpo.

27. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que la molécula efectora es una citotoxina.

28. El uso de la reivindicación 27, en el que la citotoxina se selecciona de exotoxinas de Pseudomonas o una subunidad citotóxica o mutante de la misma, toxina diftérica o una subunidad citotóxica o mutante de la misma, ricina, saporina, gelonina, caliqueamicina, doxorrubicina, ribotoxina, proteína inactivadora del ribosoma y abrina.

29. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que la exotoxina de Pseudomonas se selecciona de PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE38QQR.