EXOTOXINAS DE PSEUDOMONAS MUTADAS CON ANTIGENICIDAD REDUCIDA.

Exotoxinas de Pseudomonas mutadas con antigenicidad reducida ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0001] Los inmunoconjugados se han desarrollado en los últimos años como un enfoque terapéutico alternativo para el tratamiento del cáncer. Originalmente, los inmunoconjugados estaban compuestos de un anticuerpo conjugado químicamente con una toxina vegetal o bacteriana, una forma conocida como inmunotoxina. El anticuerpo se une al antígeno expresado en la célula diana y la toxina se interioriza y causa la muerte celular al detener la síntesis de proteínas e inducir la apoptosis (Brinkmann, U., Mol. Med. Today 2: 439-446 (1996)). Más recientemente, se han fusionado los genes que codifican el anticuerpo y la toxina y la inmunotoxina se expresa como una proteína de fusión. [0002] Se han realizado numerosos estudios sobre inmunotoxinas que usan como fracción tóxica una toxina bacteriana conocida como la exotoxina A de Pseudomonas (PE). Típicamente, la PE se ha truncado o mutado para reducir su toxicidad inespecífica sin destruir su toxicidad para las células a las que reconoce como diana por medio de la porción de reconocimiento de la inmunotoxina. Actualmente hay estudios clínicos en curso que evalúan el uso de las inmunotoxinas a base de PE como tratamientos para diversos tipos de cáncer. [0003] Las inmunotoxinas a base de PE actuales son muy inmunógenas. Esto no ha resultado ser un problema en el tratamiento de cánceres hematológicos, en los que la capacidad del sistema inmunitario de desencadenar una respuesta está frecuentemente alterada. Típicamente, las inmunotoxinas pueden administrarse varias veces a los pacientes con cánceres hematológicos. Sin embargo, los pacientes con tumores sólidos desarrollan normalmente anticuerpos neutralizantes contra las inmunotoxinas a base de PE en el espacio de semanas después de la primera administración. Dado que muchos protocolos proponen un periodo de tres semanas entre la administración de las inmunotoxinas, el desarrollo de los anticuerpos durante este periodo significa efectivamente que, para tumores sólidos, normalmente solo puede realizarse una administración de una inmunotoxina a base de PE antes de que los anticuerpos del paciente la hagan inefectiva. Incluso una única administración de una inmunotoxina a base de PE puede ser de gran utilidad para reducir la carga tumoral del paciente, eliminar pequeñas metástasis y aliviar los síntomas. No obstante, sería deseable disponer de formas menos antigénicas de las inmunotoxinas a base de PE que reducirían las respuestas inmunógenas de los pacientes. [0004] El documento US2002119492 se refiere al uso de diversos procedimientos computacionales para modular la inmunogenicidad de proteínas mediante la identificación y subsiguiente alteración de secuencias aminoacídicas potenciales que provocan una respuesta inmunitaria en un organismo hospedador. [0005] El documento WO02069886 se refiere a procedimientos para reducir la antigenicidad de un compuesto proteínico mientras se mantiene la actividad biológica del compuesto, así como a composiciones proteínicas con actividad biológica, pero con antigenicidad reducida. [0006] La publicación de Roscoe y col., European Journal of Immunology, vol. 27, n° 6, junio de 1997 (1997- 06), páginas 1459-1468, se refiere a la identificación de epítopos en una forma mutante de la exotoxina de Pseudomonas mediante el uso de suero de humanos tratados con inmunotoxinas que contenían la exotoxina de Pseudomonas. [0007] La publicación de Roscoe y col., Infection and Immunity, vol. 62, n° 11, noviembre de 1994 (1994-11), páginas 5055-5065, se refiere a una respuesta de anticuerpos de primate a una inmunotoxina: un análisis serológico y por ordenador de epítopos en una forma truncada de la exotoxina de Pseudomonas. [0008] La publicación de Frankel y col., Clinical Cancer Research, vol. 10, n° 11, 1 de enero de 2004 (2004- 01-01), páginas 13-15, se refiere a la reducción de la respuesta inmunitaria a una inmunotoxina. [0009] La publicación de Cunningham y col., Science, vol. 244, n° 4908, 2 de junio de 1989 (1989-06-02), páginas 1081-1085, se refiere al mapeo epitópico de alta resolución de las interacciones del receptor de hGH por mutagénesis de barrido con alanina. [0010] La publicación de Masanori y col., Journal of Immunology, vol. 177, n° 12, diciembre de 2006 (2006- 12), páginas 8822-8834, se refiere a la caracterización de los epítopos de las células B asociados con una forma truncada de la exotoxina de Pseudomonas (PE38) usada para preparar inmunotoxinas para el tratamiento de pacientes de cáncer. 2   RESUMEN DE LA INVENCIÓN [0011] La presente invención proporciona una exotoxina A de Pseudomonas (PE) aislada, en que dicha PE tiene una sustitución con alanina, glicina, serina o glutamina en lugar del resto aminoacídico R432, en que el resto aminoacídico R432 se define en referencia a la secuencia de aminoácidos de la PE nativa (SEQ ID NO:1). [0012] En una realización, dicha PE tiene además una sustitución con alanina, valina, glicina, leucina, isoleucina o glutamina en lugar de la arginina en el resto 490, en que dicha numeración de aminoácidos se define en referencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1. El sustituto de dicho resto aminoacídico 490 de SEQ ID NO:1 puede ser alanina. [0013] La PE puede seleccionarse del grupo que consta de PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE38QQR. [0014] La PE puede comprender además una o más de las sustituciones R313A, Q332S, R467A, R490A, R513A, E548S y K590S, como las sustituciones R313A, Q332S, R432G, R467A, R490A, R513A, E548S y K590S. [0015] En otra realización, la invención proporciona una molécula quimérica que comprende (a) una fracción de reconocimiento conjugada o fusionada con (b) una exotoxina A de Pseudomonas (PE), en que dicha PE tiene una sustitución con alanina, glicina, serina o glutamina en lugar del resto aminoacídico R432, en que dicho resto aminoacídico R432 se define en referencia a la secuencia de aminoácidos de la PE nativa (SEQ ID NO:1). [0016] La molécula quimérica puede comprender una PE tal como se define anteriormente. [0017] La fracción de reconocimiento de la molécula quimérica puede ser un anticuerpo, por ejemplo, seleccionado del grupo que consta de un scFv, un dsFv, un Fab y un F(ab)2. [0018] En una alternativa, la fracción de reconocimiento de la molécula quimérica puede ser una citocina. [0019] La invención proporciona además una composición que comprende (a) una molécula quimérica tal como se describe anteriormente y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable. [0020] En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una exotoxina A de Pseudomonas (PE) modificada tal como se define anteriormente y que opcionalmente codifica además una fracción de reconocimiento, como una fracción de reconocimiento tal como se define anteriormente. [0021] Opcionalmente, el ácido nucleico aislado de la invención puede estar ligado operativamente a un promotor. [0022] En otro aspecto, se proporciona un procedimiento in vitro para inhibir el crecimiento de una célula que porta una molécula diana, en que dicho procedimiento comprende la puesta en contacto de dicha célula con una molécula quimérica de la invención, en que la puesta en contacto de dicha célula con dicha molécula quimérica inhibe el crecimiento de dicha célula. [0023] La invención proporciona además una molécula quimérica de acuerdo con la invención para el uso en un procedimiento de tratamiento, en que dicho tratamiento es destruir las células reconocidas como diana por dicha molécula. En algunas realizaciones, la molécula diana es un receptor de citocina y dicha fracción de reconocimiento es una citocina que se une a dicho receptor. En algunas realizaciones, la molécula diana es un receptor de IL-13 y dicha molécula de reconocimiento es una IL-13, una IL-13 mutada o una IL-13 permutada circularmente. En algunas realizaciones, la molécula diana es un antígeno y dicha molécula de reconocimiento es un anticuerpo que se une específicamente a dicho antígeno. En algunas realizaciones, el antígeno es un antígeno de cáncer. [0024] La invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende la PE de la invención tal como se describe anteriormente o la molécula quimérica de la invención tal como se describe anteriormente, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para el uso en un procedimiento de tratamiento. [0025] En este documento también se describen a continuación PE aisladas que tienen una sustitución con alanina, glicina, serina o glutamina en lugar de un resto aminoacídico que corresponde a un resto aminoacídico de SEQ ID NO:1 seleccionado del grupo que consta de E282, E285, P290, R313, N314, P319, D324, E327, E331, Q332, D4Q3, R412, R427, E431, R432, R458, D461, R467, R505,... [Seguir leyendo]

1. Una exotoxina A de Pseudomonas (PE) aislada, en que dicha PE tiene una sustitución con alanina, glicina, serina o glutamina en lugar del resto aminoacídico R432, en que el resto aminoacídico R432 se define en referencia a la secuencia de aminoácidos de la PE nativa (SEQ ID NO:1). 2. Una PE de acuerdo con la reivindicación 1, en que dicha PE tiene además una sustitución con alanina, valina, glicina, leucina, isoleucina o glutamina en lugar de la arginina en el resto 490, en que dicho resto aminoacídico se define en referencia a la secuencia de aminoácidos de la PE nativa (SEQ ID NO:1). 3. Una PE de la reivindicación 2, en que además dicho sustituto de dicho resto aminoacídico 490 de SEQ ID NO:1 es alanina. 4. Una PE de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que dicha PE se selecciona del grupo que consta de PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE38QQR. 5. Una PE de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que dicha PE comprende además una o más de las sustituciones R313A, Q332S, R467A, R490A, R513A, E548S y K590S. 20 6. Una PE según la reivindicación 5, en que dicha PE comprende las sustituciones R313A, Q332S, R432G, R467A, R490A, R513A, E548S yK590S. 7. Una molécula quimérica que comprende (a) una fracción de reconocimiento conjugada o fusionada con (b) una exotoxina A de Pseudomonas (PE), en que dicha PE tiene una sustitución con alanina, glicina, serina o glutamina en lugar del resto aminoacídico R432, en que dicho resto aminoacídico R432 se define en referencia a la secuencia de aminoácidos de la PE nativa (SEQ ID NO:1). 8. Una molécula quimérica de la reivindicación 7, en que dicha PE es tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6. 9. Una molécula quimérica de las reivindicaciones 7 u 8, en que dicha fracción de reconocimiento es un anticuerpo. 10. Una molécula quimérica de la reivindicación 9, en que dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consta de un scFv, un dsFv, un Fab y un F(ab)2. 11. Una molécula quimérica de las reivindicaciones 7 u 8, en que dicha fracción de reconocimiento es una citocina. 40 12. Una composición que comprende (a) una molécula quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.   13. Un ácido nucleico aislado que codifica una exotoxina A de Pseudomonas (PE) modificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y que opcionalmente codifica además una fracción de reconocimiento. 14. Un ácido nucleico aislado de la reivindicación 13, en que dicha fracción de reconocimiento es tal como se define en las reivindicaciones 9, 10 u 11. 15. Un ácido nucleico aislado de las reivindicaciones 13 o 14, en que dicho ácido nucleico está ligado operativamente a un promotor. 16. Un procedimiento in vitro para la inhibición del crecimiento de una célula que porta una molécula diana, en que dicho procedimiento comprende la puesta en contacto de dicha célula con una molécula quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en que la puesta en contacto de dicha célula con dicha molécula quimérica inhibe el crecimiento de dicha célula. 17. Una molécula quimérica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 para el uso en un procedimiento de tratamiento, en que dicho tratamiento es destruir las células reconocidas como diana por dicha molécula. 18. Una composición farmacéutica que comprende la PE de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o la molécula quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable para el uso en un procedimiento de tratamiento.   36   37   38   39     41