Exotoxinas de pseudomonas mutadas con antigenicidad reducida.

Una exotoxina A de Pseudomonas ("PE") aislada, en que dicha PE tiene una sustitución con alanina,

glicina, serina o glutamina en lugar del resto aminoacídico R513, en que el resto aminoacídico R513 se define enreferencia a la secuencia de aminoácidos de la PE nativa (SEQ ID NO:1).

Exotoxinas de pseudomonas mutadas con antigenicidad reducida 5 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los inmunoconjugados se han desarrollado en los ultimos aros como un enfoque terapeutico alternativo para el tratamiento del cancer. Originalmente, los inmunoconjugados estaban compuestos de un anticuerpo conjugado quimicamente con una toxina vegetal o bacteriana, una forma conocida como inmunotoxina. El

anticuerpo se une al antigeno expresado en la celula diana y la toxina se interioriza y causa la muerte celular al detener la sintesis de proteinas e inducir la apoptosis (Brinkmann, U., Mol. Med. Today 2: 439-446 (1996) ) . Mas recientemente, se han fusionado los genes que codifican el anticuerpo y la toxina y la inmunotoxina se expresa como una proteina de fusion.

Se han realizado numerosos estudios sobre inmunotoxinas que usan como fraccion toxica una toxina bacteriana conocida como la exotoxina A de Pseudomonas ("PE") . Tipicamente, la PE se ha truncado o mutado para reducir su toxicidad inespecifica sin destruir su toxicidad para las celulas a las que reconoce como diana por medio de la porcion de reconocimiento de la inmunotoxina. Actualmente hay estudios clinicos en curso que evaluan el uso de las inmunotoxinas a base de PE como tratamientos para diversos tipos de cancer.

Las inmunotoxinas a base de PE actuales son muy inmunogenas. Esto no ha resultado ser un problema en el tratamiento de canceres hematologicos, en los que la capacidad del sistema inmunitario de desencadenar una respuesta esta frecuentemente alterada. Tipicamente, las inmunotoxinas pueden administrarse varias veces a los pacientes con canceres hematologicos. Sin embargo, los pacientes con tumores solidos desarrollan normalmente anticuerpos neutralizantes contra las inmunotoxinas a base de PE en el espacio de semanas despues de la primera administracion. Dado que muchos protocolos proponen un periodo de tres semanas entre la administracion de las inmunotoxinas, el desarrollo de los anticuerpos durante este periodo significa efectivamente que, para tumores solidos, normalmente solo puede realizarse una administracion de una inmunotoxina a base de PE antes de que los anticuerpos del paciente la hagan inefectiva. Incluso una unica administracion de una inmunotoxina a base de PE puede ser de gran utilidad para reducir la carga tumoral del paciente, eliminar pequeras metastasis y aliviar los sintomas. No obstante, seria deseable disponer de formas menos antigenicas de las inmunotoxinas a base de PE que reducirian las respuestas inmunogenas de los pacientes. [0004] El documento US2002119492 se refiere al uso de diversos procedimientos computacionales para modular la inmunogenicidad de proteinas mediante la identificacion y subsiguiente alteracion de secuencias aminoacidicas potenciales que provocan una respuesta inmunitaria en un organismo hospedador. [0005] El documento WO02069886 se refiere a procedimientos para reducir la antigenicidad de un compuesto proteinico mientras se mantiene la actividad biologica del compuesto, asi como a composiciones proteinicas con actividad biologica, pero con antigenicidad reducida. [0006] La publicacion de Roscoe y col., European Journal of Immunology, vol. 27, n° 6, junio de 1997 (199706) , paginas 1459-1468, se refiere a la identificacion de epitopos en una forma mutante de la exotoxina de Pseudomonas mediante el uso de suero de humanos tratados con inmunotoxinas que contenian la exotoxina de 45 Pseudomonas. [0007] La publicacion de Roscoe y col., Infection and Immunity, vol. 62, n° 11, noviembre de 1994 (1994-11) , paginas 5055-5065, se refiere a una respuesta de anticuerpos de primate a una inmunotoxina: un analisis serologico y por ordenador de epitopos en una forma truncada de la exotoxina de Pseudomonas.

La publicacion de Frankel y col., Clinical Cancer Research, vol. 10, n° 11, 1 de enero de 2004 (200401-01) , paginas 13-15, se refiere a la reduccion de la respuesta inmunitaria a una inmunotoxina. [0009] La publicacion de Cunningham y col., Science, vol. 244, n° 4908, 2 de junio de 1989 (1989-06-02) ,

paginas 1081-1085, se refiere al mapeo epitopico de alta resolucion de las interacciones del receptor de hGH por mutagenesis de barrido con alanina.

La publicacion de Masanori y col., Journal of Immunology, vol. 177, n° 12, diciembre de 2006 (200612) , paginas 8822-8834, se refiere a la caracterizacion de los epitopos de las celulas B asociados con una forma truncada de la exotoxina de Pseudomonas (PE38) usada para preparar inmunotoxinas para el tratamiento de pacientes de cancer.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La presente invencion proporciona una exotoxina A de Pseudomonas ("PE") aislada, en que dicha PE tiene una sustitucion con alanina, glicina, serina o glutamina en lugar del resto aminoacidico R513, en que el resto aminoacidico R513 se define en referencia a la secuencia de aminoacidos de la PE nativa (SEQ ID NO:1) .

En una realizacion, dicha PE tiene ademas una sustitucion con alanina, valina, glicina, leucina, isoleucina o glutamina en lugar de la arginina en el resto 490, en que dicha numeracion de aminoacidos se define en referencia a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1. El sustituto de dicho resto aminoacidico 490 de SEQ ID NO:1 puede ser alanina.

La PE puede seleccionarse del grupo que consta de PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE38QQR.

La PE puede comprender ademas una o mas de las sustituciones R313A, Q332S, R432G, R467A, R490A, E548S y K590S. Un ejemplo de dicha PE es aquella con las sustituciones R313A, Q332S, R432G, R467A,

R490A, R513A, E548S y K590S.

En otra realizacion, la invencion proporciona una molecula quimerica que comprende (a) una fraccion de reconocimiento conjugada o fusionada con (b) una exotoxina A de Pseudomonas ("PE") , en que dicha PE tiene una sustitucion con alanina, glicina, serina o glutamina en lugar del resto aminoacidico R513, en que el resto aminoacidico R513 se define en referencia a la secuencia de aminoacidos de la PE nativa (SEQ ID NO:1) .

La molecula quimerica puede comprender una PE tal como se define anteriormente.

La fraccion de reconocimiento de la molecula quimerica puede ser un anticuerpo, por ejemplo, 30 seleccionado del grupo que consta de un scFv, un dsFv, un Fab y un F (ab') 2.

En una alternativa, la fraccion de reconocimiento de la molecula quimerica puede ser una citocina.

La invencion proporciona ademas una composicion que comprende (a) una molecula quimerica tal 35 como se describe anteriormente y (b) un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invencion proporciona un acido nucleico aislado que codifica una exotoxina A de Pseudomonas ("PE") modificada tal como se define anteriormente y que opcionalmente codifica ademas una fraccion de reconocimiento, como una fraccion de reconocimiento tal como se define anteriormente.

Opcionalmente, el acido nucleico aislado de la invencion puede estar ligado operativamente a un promotor.

En otro aspecto, se proporciona un procedimiento in vitro para inhibir el crecimiento de una celula que 45 porta una molecula diana, en que dicho procedimiento comprende la puesta en contacto de dicha celula con una molecula quimerica de la invencion, en que la puesta en contacto de dicha celula con dicha molecula quimerica inhibe el crecimiento de dicha celula.

La invencion proporciona ademas una molecula quimerica de acuerdo con la invencion para el uso en 50 un procedimiento de tratamiento, en que dicho tratamiento es destruir las celulas reconocidas como diana por dicha molecula. En algunas realizaciones, la molecula diana es un receptor de citocina y dicha fraccion de reconocimiento es una citocina que se une a dicho receptor. En algunas realizaciones, la molecula diana es un receptor de IL-13 y dicha molecula de reconocimiento es una IL-13, una IL-13 mutada o una IL-13 permutada circularmente. En algunas realizaciones, la molecula diana es un antigeno y dicha molecula de reconocimiento es un anticuerpo que se une 55 especificamente a dicho antigeno. En algunas realizaciones, el antigeno es un antigeno de cancer.

La invencion proporciona tambien una composicion farmaceutica que comprende la PE de la invencion tal como se describe anteriormente o la molecula quimerica de la invencion tal como se describe anteriormente, junto con un vehiculo farmaceuticamente aceptable, para el uso en un procedimiento de tratamiento.

En este documento tambien se describen a continuacion PE aisladas que tienen una sustitucion con alanina, glicina, serina o glutamina en lugar de un resto aminoacidico que corresponde a un resto aminoacidico de SEQ ID NO:1 seleccionado del grupo que consta de E282, E285, P290, R313, N314, P319, D324, E327, E331, 5 Q332, D4Q3, R412, R427, E431, R432, R458, D461,... [Seguir leyendo]

1. Una exotoxina A de Pseudomonas ("PE") aislada, en que dicha PE tiene una sustitucion con alanina,

glicina, serina o glutamina en lugar del resto aminoacidico R513, en que el resto aminoacidico R513 se define en 5 referencia a la secuencia de aminoacidos de la PE nativa (SEQ ID NO:1) .

2. Una PE de acuerdo con la reivindicacion 1, en que dicha PE tiene ademas una sustitucion con alanina, valina, glicina, leucina, isoleucina o glutamina en lugar de la arginina en el resto 490, en que dicho resto aminoacidico se define en referencia a la secuencia de aminoacidos de la PE nativa (SEQ ID NO:1) .

3. Una PE de la reivindicacion 2, en que ademas dicho sustituto de dicho resto aminoacidico 490 de SEQ ID NO:1 es alanina.

4. Una PE de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que dicha PE se 15 selecciona del grupo que consta de PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE38QQR.

5. Una PE de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que dicha PE comprende ademas una o mas de las sustituciones R313A, Q332S, R432G, R467A, R490A, E548S y K590S.

6. Una molecula quimerica que comprende (a) una fraccion de reconocimiento conjugada o fusionada con (b) una exotoxina A de Pseudomonas ("PE") , en que dicha PE tiene una sustitucion con alanina, glicina, serina o glutamina en lugar del resto aminoacidico R513, en que dicho resto aminoacidico R513 se define en referencia a la secuencia de aminoacidos de la PE nativa (SEQ ID NO:1) .

7. Una molecula quimerica de la reivindicacion 6, en que dicha PE es tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.

8. Una molecula quimerica de las reivindicaciones 6 o 7, en que dicha fraccion de reconocimiento es un anticuerpo. 30

9. Una molecula quimerica de la reivindicacion 8, en que dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consta de un scFv, un dsFv, un Fab y un F (ab') 2.

10. Una molecula quimerica de las reivindicaciones 6 o 7, en que dicha fraccion de reconocimiento es una 35 citocina.

11. Una composicion que comprende (a) una molecula quimerica de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 y (b) un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

12. Un acido nucleico aislado que codifica una exotoxina A de Pseudomonas ("PE") modificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y que opcionalmente codifica ademas una fraccion de reconocimiento.

13. Un acido nucleico aislado de la reivindicacion 12, en que dicha fraccion de reconocimiento es tal como se define en las reivindicaciones 8, 9 o 10. 45

14. Un acido nucleico aislado de las reivindicaciones 12 o 13, en que dicho acido nucleico esta ligado operativamente a un promotor.

15. Un procedimiento in vitro para la inhibicion del crecimiento de una celula que porta una molecula

diana, en que dicho procedimiento comprende la puesta en contacto de dicha celula con una molecula quimerica de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en que la puesta en contacto de dicha celula con dicha molecula quimerica inhibe el crecimiento de dicha celula.

16. Una molecula quimerica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 para el uso en 55 un procedimiento de tratamiento, en que dicho tratamiento es destruir las celulas reconocidas como diana por dicha molecula.

17. Una composicion farmaceutica que comprende la PE de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o la molecula quimerica de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 junto con un vehiculo farmaceuticamente aceptable para el uso en un procedimiento de tratamiento.