Sustitutos de piel mejorados y usos de los mismos.

Composición que comprende un cultivo humano derivado in vitro de queratinocitos que se ha estratificado en epitelio escamoso (equivalente de piel),

teniendo dicho equivalente de piel una capacitancia eléctrica de superficie de 40 a 240 pF, medida como la diferencia en la lectura sobre un intervalo de 10 segundos, y en la que el contenido combinado de las ceramidas 5, 6, y 7 en dicho equivalente de piel es del 20 al 50% del contenido total de ceramida, en la que dichos queratinocitos son Células de Queratinocitos Inmortalizadas Casi Diploides.

Sustitutos de piel mejorados y usos de los mismos [0001] Esta solicitud reivindica prioridad de las solicitudes de patente provisionales de Estados Unidos de números de serie 60/287, 898, presentada el 5/01/2001 y 60/273, 034, presentada el 3/02/2001 y las solicitudes de patente de Estados Unidos de números de serie no asignado presentada el 3/1/02 con Express Mail Label XXX, número de serie no asignado presentada el 3/1/02 con Express Mail Label XXX, y el número de serie no asignado presentada el 3/1/02 con Express Mail Label XXX. Esta solicitud de patente está apoyada en parte por las subvenciones de NIH SBIR 1 R43 AR47499-01 y 1 R43 ES10692-01A1.

Campo de la invención [0002] La presente invención se refiere a sustitutos de la piel cultivados in vitro, y en particular a sustitutos de la piel cultivados in vitro que presentan una función de barrera mejorada tal como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la función de barrera mejorada es el resultado de condiciones de cultivo mejoradas, mientras que en otras realizaciones, la función de barrera mejorada resulta de la modificación genética de los queratinocitos. La presente invención se refiere además al uso de dichos sustitutos de piel para analizar la irritante.

Antecedentes de la invención [0003] Existe un amplio mercado para productos y servicios de análisis que predicen los efectos de la función de barrera de la piel. Existe una particular necesidad de ensayos validados que permitirían a compañías con compuestos en una fase temprana analizar la función de barrera sin recurrir a pruebas caras de parches en humanos y animales. Las compañías cosméticas gastan aproximadamente de 50 millones a 100 millones de dólares por año en este tipo de ensayo. Las compañías de productos domésticos y farmacéuticas tienen gastos similares.

Además, existe un mercado sustancial para productos para terapia de las quemaduras y para la reparación o soporte de tejidos epiteliales apropiados y otros usos de cicatrización de heridas y de la piel. Por ejemplo, las úlceras venosas en las piernas afectan a aproximadamente 1 millón de personas en los Estados Unidos y 3 millones a nivel mundial, y otras afecciones ulcerosas, tales como las úlceras diabéticas y las úlceras por presión (“bedsore”) , afectan aproximadamente a 10 millones de personas a nivel mundial. El cuidado habitual de las úlceras venosas puede llevar más de 6 meses para curar una herida y el coste puede sobrepasar los 10.000 dólares. Además, las úlceras en los pies son la causa principal de la hospitalización entre diabéticos y se estima que tiene un coste anual para el sistema de salud de Estados Unidos de más de 1.000 millones de dólares. Las estimaciones para las hospitalizaciones anuales por quemaduras en los Estados Unidos puede variar de 60.000 a 80.000 y los costes para la recuperación de las lesiones agudas varían de 36.000 a 117.000 dólares por paciente.

La función principal de la piel humana es proporcionar una barrera para la pérdida de agua transcutánea y una barrera para prevenir la entrada de compuestos tóxicos o microorganismos. El desarrollo de la barrera de permeabilidad epidérmica requiere la síntesis coordinada y el metabolismo de productos proteicos y lipídicos específicos de los queratinocitos que se ensamblan en la capa de la piel más externa, el estrato córneo. La expresión de muchas de las enzimas clave requeridas para la síntesis de estos lípidos extracelulares se regula por incremento durante la diferenciación de los queratinocitos o después de la alteración de la función de barrera epidérmica, lo que sugiere la existencia de factores de transcripción que actúan para inducir el desarrollo de la función de barrera (Sando et al., J. Biol. Chem., 271 (36) : 22044-51 (1996) ; Watanabe et al., J. Biol. Chem., 273 (16) : 9651-5 (1998) ) . La función de barrera se ve disminuida por la exposición a sustancias irritantes, por la infección y por un conjunto de enfermedades que incluyen dermatitis atópica y psoriasis. El estrés del entorno puede exacerbar los efectos de estas afecciones en la función de barrera esencial de la piel. Muchas industrias están interesadas en qué efecto tienen sus productos en la función de barrera de la piel. Por ejemplo, las compañías que suministrar compuestos farmacéuticos por vía transdérmica necesitan facilitar la penetración del agente activo a través del barrera. Las compañías cosméticas están interesadas en hallar formulaciones que mejorar la función de la barrera.

A efectos de ensayar compuestos o formulaciones de manera temprana en el proceso de desarrollo con velocidad y precisión, sería beneficioso tener un sistema de ensayo in vitro que mimetice las propiedades de barrera de la piel humana. Sin embargo, los estudios publicados indican que los cultivos equivalentes de piel existentes, tales como EPIDERM, SKINETHICS o EPISKIN, presentan una función de barrera muy escasa (Ponec et al., J. Invest. Dermatol., 109 (3) : 348-55 (1997) ) . Sin embargo, existe un progreso reciente sustancial en el entendimiento de la importancia de la vitamina C, receptores nucleares de hormonas, síntesis de lípidos, y humedad en el desarrollo correcto de la función barrera (Ponec et al., J. Invest. Dermatol., 109 (3) : 348-55 (1997) ; Denda et al., J. Invest. Dermatol., 111 (5) : 858-63 (1998) ; Hanley et al., J. Clin. Invest., 100 (3) : p. 705-12 (1997) ; Hanley et al., J. Invest. Dermatol., 113 (5) : 788-95 (1999) ) . En muchos casos, estos estudios se centran en las señales químicas o ambientales que desencadenan el programa de desarrollo natural que establece la función de barrera en un tiempo específico in utero. Claramente, existe una gran necesidad de sustitutos de la piel que tengan una función de barrera mejorada.

Descripción resumida de la invención [0007] La presente invención se refiere a composiciones tal como se define en las reivindicaciones.

La presente invención proporciona composiciones que comprende un equivalente de piel humano, teniendo el equivalente de piel una capacitancia eléctrica de superficie de 40 a 240 pF. En algunas realizaciones preferidas, el equivalente de piel tiene una capacitancia eléctrica de superficie de aproximadamente 80 a aproximadamente 120 pF. El contenido combinado de ceramidas 5, 6, y 7 en el equivalente de piel es del 20 al 50% del contenido total de ceramida. En otras realizaciones preferidas, el contenido de ceramida 2 en el equivalente de piel es del 10 al 40% del contenido total de ceramida. La presente solicitud proporciona realizaciones adicionales que no forman parte de la invención.

En algunas realizaciones, la presente solicitud proporciona queratinocitos aislados que comprenden una secuencia que codifica GKLF unido operativamente a un promotor exógeno. En otras realizaciones, la presente solicitud proporciona queratinocitos de un cultivo organotípico que comprenden una secuencia que codifica GKLF exógeno unido operativamente un promotor exógeno.

En algunas realizaciones, la presente solicitud proporciona métodos para fabricar equivalentes de piel que tienen una función de barrera mejorada. En algunas realizaciones, los métodos comprenden proporcionar queratinocitos y un medio de cultivo que comprende ácido ascórbico y ácido linoleico; y cultivar los queratinocitos bajo condiciones tales que se forma un equivalente de piel con una función de barrera mejorada. En algunas realizaciones, las condiciones de cultivo incluyen cultivo a aproximadamente 50 al 95% de humedad, preferiblemente aproximadamente el 75% de humedad. En algunas realizaciones preferidas, el ácido ascórbico se proporciona a una concentración de aproximadamente 10 a 100 microgramos/ml. En realizaciones adicionales preferidas, el ácido linoleico se proporciona en una concentración de aproximadamente 5 a 80 micromolar. La presente solicitud no se limita a equivalentes de piel formados a partir de una fuente particular de queratinocitos. De hecho, los equivalentes de piel se pueden formar a partir de una variedad de queratinocitos primarios e inmortales, que incluyen, pero sin limitación, células NIKS. En otras realizaciones, los queratinocitos expresan GKLF exógeno de tipo natural o variante. En otras realizaciones, los queratinocitos derivan de dos fuentes diferentes. En otras realizaciones, el equivalente de piel tiene una capacitancia eléctrica de superficie de aproximadamente 40 a aproximadamente 240 pF. En algunas realizaciones preferidas, el equivalente de piel tiene una capacitancia eléctrica de superficie de aproximadamente 80 a aproximadamente 120 pF. En otras realizaciones preferidas, el contenido de ceramidas 5, 6, y 7 en el equivalente de piel es de aproximadamente 20 a aproximadamente 50% del contenido total de ceramida. En... [Seguir leyendo]

1. Composición que comprende un cultivo humano derivado in vitro de queratinocitos que se ha estratificado en epitelio escamoso (equivalente de piel) , teniendo dicho equivalente de piel una capacitancia eléctrica de superficie de 40 a 240 pF, medida como la diferencia en la lectura sobre un intervalo de 10 segundos, y en la que el contenido combinado de las ceramidas 5, 6, y 7 en dicho equivalente de piel es del 20 al 50% del contenido total de ceramida, en la que dichos queratinocitos son Células de Queratinocitos Inmortalizadas Casi Diploides.

2. Composición, según la reivindicación 1, teniendo dicho equivalente de piel humano una capacitancia eléctrica de 10 superficie de 80 a aproximadamente 120 pF.

3. Composición, según la reivindicación 1 ó 2, en la que el contenido de ceramida 2 en dicho equivalente de piel es de aproximadamente 10 al 40% del contenido total de ceramida.

4. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo dichas Células de Queratinocitos Inmortalizadas Casi Diploides una construcción génica informadora sensible a irritante.

5. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para utilizar en la cicatrización de heridas y/o el

tratamiento de quemaduras de un paciente que sufre una herida. 20