Sistemas de expresión para el control de insectos dañinos.

Un sistema de expresión génica que se puede reprimir, operativo en un insecto,

que comprende dos elementosen la misma construcción, en la que:

el primer elemento comprende al menos un gen de factor de control que hay que expresar y al menos un primerpromotor del mismo; y el segundo elemento comprende al menos un segundo promotor y un gen de interés bajo elcontrol de dicho al menos un segundo promotor;

en el que un producto del gen de factor de control que hay que expresar sirve como factor de control de latranscripción positivo para ambos, el al menos un primer promotor en dicho primer elemento y el al menos unsegundo promotor en dicho segundo elemento, con lo que dicho producto del gen de factor de control, o la expresiónde dicho producto del gen factor de control, se puede reprimir,

siendo el primer y el segundo promotores, promotores mínimos de insecto, que pueden ser el mismo o diferentes.

Sistemas de expresión para el control de insectos dañinos La presente invención se refiere a sistemas de expresión en insectos que comprenden un promotor.

La manipulación genética de insectos distintos de Drosophila melanogaster, por procedimientos de ADN recombinante está en su infancia (Alphey, 2002; Alphey y Andreasen, 2002; Alphey y col., 2002; Benedict y Robinson, 2003; Berghammer y col., 1999; Catteruccia y col., 2000; Coates y col., 1998; Handler, 2002; Horn y col.,

2002; Jasinskiene y col., 1998; Lobo y col., 2002; Lozovsky y col., 2002; McCombs y Saul, 1995; Moreira y col., 2004; Peloquin y col., 2000; Perera y col., 2002; Scott y col., 2004) , y se han obtenido muy pocas líneas transgénicas de insectos no-Drosophila, utilizando promotores heterólogos.

La transformación de insectos es un sistema de baja eficacia que requiere la identificación de transformantes escasos, en un contexto con un gran número de individuos no transformados. Por tanto, es importante que los transformantes tengan un marcador fácilmente valorable. Actualmente los marcadores favoritos son las proteínas fluorescentes, tales como la GFP, DsRed y sus derivados mutantes. Estos requieren elementos de control de la transcripción, incluyendo un promotor, para su funcionamiento. Los mejor conocidos de estos son los genes de la Drosophila Actin5C (Act5C) y ubi-p63E (Pub) . También se ha utilizado una seda de polilla homóloga de Act5C, el

BmA3, así como un par de promotores específicos de tejido (3xP3, un promotor sintético específico de ojo, y Act88F, específico de los músculos indirectos de vuelo) .

Sin embargo, ninguno de estos promotores es satisfactorio completamente. El Act5C se ha utilizado para transformar varios mosquitos, así como Drosophila, pero su patrón de expresión en mosquitos está lejos de ser 25 ubicuo (Catteruccia y col., 2000; Pinkerton y col., 2000) . Los esfuerzos para utilizarlo como parte de un marcador de transformación en la mosca mediterránea de la fruta (Ceratitis capitata) han fallado, donde los experimentos con Pub habían conseguido un buen resultado. El Pub tiene limitaciones similares: el patrón de expresión que se ha visto en los transformantes de la mosca mediterránea de la fruta es muy variable, sugiriendo que el patrón de expresión es al menos muy sensible al efecto de posición. Además, ninguno de estos promotores se puede regular en un sentido o activarse o desactivarse si se desea.

Fussenegger y col., (1998a; 1998b) ilustra una retroalimentación positiva que controla transcripciones multicistrónicas, utilizando un marcador de selección, en un ejemplo. Los experimentos se restringieron a sistemas mamíferos. Se describe el pTRIDENT como un operón artificial mamífero tricistrónico. Se ha descrito la expresión o 35 la expresión transitoria de genes del ciclo celular detenidos para “manipulación metabólica”, es decir, que regulan la expresión de proteínas deseadas, y se menciona que un efecto de “silenciamiento” del dominio transactivador VP16 puede ser letal para la célula huésped, incluso a niveles de expresión moderados (Berger y col., 1990; Damke y col., 1995; Gill y Ptashne, 1988; Gossen y Bujard, 1992; Salghetti y col., 2001) . Se han tratado los beneficios de los sistemas autorreguladores mono o policistrónicos, incluyendo los sistemas de expresión multicistrónicos selectivos 40 de mamíferos que incluyen el tTA en una configuración basada en pTRIDENT o una configuración tetracistrónica (pQuatro-tTA; Fussenegger y col., (1998b) ; Figura 2) . Aunque el gen tTA se codifica en la unidad de expresión multicistrónica por sí misma, no se expresa o se expresa poco tTA bajo condiciones de restricción. Este sistema de regulación por retroalimentación positiva no muestra signos de silenciamiento. Los experimentos con una configuración monocistrónica de retroalimentación positiva en animales transgénicos, tampoco ha mostrado efectos 45 perjudiciales (Shockett y col., 1995) .

Se han caracterizado muy pocos promotores u otros elementos de control, y existe una necesidad acuciante para tales elementos. Sería deseable proporcionar un promotor universal activo en todas o casi todas las células de un amplio intervalo de insectos, o que fuera capaz de una utilización más amplia que un promotor existente. Una 50 pretensión más es regular la actividad de los promotores de insectos, especialmente en una manera de estadio de vida y/o específica de sexo. También se pretende reducir o eliminar selectivamente la actividad del promotor en células o tejidos particulares. La presente invención proporciona tales sistemas.

Sorprendentemente, se ha descubierto ahora que es posible emplear un mecanismo de retroalimentación positiva 55 tanto para mejorar el efecto de un promotor de insectos, así como para controlar su expresión.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un sistema de expresión génica de insectos, que comprende al menos un gen que hay que expresar y al menos un promotor del mismo, en el que el producto del gen que hay que expresar sirve como factor de control positivo de la transcripción para al menos un promotor, y que es 60 controlable por el producto, o la expresión del producto.

Como se utiliza en el presente documento, el término “gen” se refiere a cualquier secuencia de ADN que se pueda transcribir o traducir en un producto, al menos uno de los cuales tiene una actividad o función in vivo. Tal gen normalmente tendrá al menos un promotor de transcripción y un terminador asociado operativamente con él.

El producto capaz del control positivo de la transcripción puede actuar de cualquier manera adecuada. En particular, el producto se puede unir a un potenciador localizado en las proximidades del promotor o promotores, sirviendo de esta manera para mejorar la unión de la polimerasa al promotor, por ejemplo. Se pueden emplear otros mecanismos, tales como contra un represor de los mecanismos, tal como el bloqueo de un inhibidor de la transcripción o la traducción. Los inhibidores de la transcripción se pueden bloquear, por ejemplo, utilizando ARN en horquilla o ribozimas para bloquear la traducción del ARNm que codifica el inhibidor, por ejemplo, o el producto se puede unir al inhibidor directamente, previniendo de esta manera la inhibición de la transcripción o la traducción.

Más preferentemente, el mecanismo es un mecanismo de retroalimentación positiva, en el que el producto, que puede ser el ARN o el producto de la traducción del mismo, actúa en el sitio del potenciador de la transcripción, normalmente uniéndose al sitio, y así aumentando la actividad promotora. El aumento de la actividad promotora sirve entonces para incrementar la transcripción del gen para el producto, que a su vez, además sirve para elevar la inhibición o mejorar la promoción, llevando de esta manera a un bucle de retroalimentación positiva.

El control del producto puede ser por cualquier medio adecuado, y puede efectuarse a cualquier nivel. Se prefiere que el control sea eficaz bien para bloquear la transcripción del gen de factor de control o para bloquear la traducción del producto ARN del mismo, o para prevenir o inhibir la acción de la traducción del producto del gen.

Por ejemplo, el producto del gen tTA (activador de transcripción que se reprime en presencia de tetraciclina) actúa en la secuencia del operador tetO (Baron y Bujard, 2000; Gossen y col., 1994; Gossen y Bujard, 1992) . Corriente arriba de un promotor, en cualquier orientación, cuando el tetO se une al producto del gen tTA, es capaz de aumentar los niveles de transcripción a partir de un promotor que esté muy próximo al mismo. Si el gen tTA es parte del casete que comprende el operador tetO junto con el promotor, se produce entonces la retroalimentación positiva cuando se expresa el producto génico del tTA.

El control de este sistema se consigue fácilmente por exposición a la tetraciclina, la cual se une al producto génico e impide la transactivación del tetO.

El sistema tTA también tiene la ventaja de proporcionar una toxicidad específica del estadio en varias especies. En particular, se observa el “silenciamiento” en las fases de desarrollo de muchos insectos, siendo la fase precisa de los insectos susceptibles dependiente de la especie. Algunos insectos pueden alcanzar el estadio de pupa antes de que muera la larva, mientras que otros mueren antes. La susceptibilidad varía del 100 % de mortalidad a una pequeña reducción de las tasas de supervivencia. Sin embargo, en general, los insectos adultos parecen ser inmunes al efecto de silenciamiento de tTA, por lo que es posible criar insectos que comprendan un sistema tTA de retroalimentación... [Seguir leyendo]

1. Un sistema de expresión génica que se puede reprimir, operativo en un insecto, que comprende dos elementos en la misma construcción, en la que: el primer elemento comprende al menos un gen de factor de control que hay que expresar y al menos un primer promotor del mismo; y el segundo elemento comprende al menos un segundo promotor y un gen de interés bajo el control de dicho al menos un segundo promotor; en el que un producto del gen de factor de control que hay que expresar sirve como factor de control de la transcripción positivo para ambos, el al menos un primer promotor en dicho primer elemento y el al menos un segundo promotor en dicho segundo elemento, con lo que dicho producto del gen de factor de control, o la expresión de dicho producto del gen factor de control, se puede reprimir, siendo el primer y el segundo promotores, promotores mínimos de insecto, que pueden ser el mismo o diferentes.

2. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se asocia un potenciador con el, o cada, promotor mínimo de insecto, sirviendo el producto génico para potenciar la actividad del, o cada, promotor mínimo de insecto por medio del potenciador.

3. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el factor del control es el producto génico tTA o un análogo que se puede reprimir del mismo, y en el que una o más unidades operadoras tetO están unidas operativamente al promotor y es el potenciador, sirviendo tTA o sus análogos para potenciar la actividad del promotor por medio del tetO.

4. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el gen de factor de control codifica el producto tTAV (SEC ID Nº 32) .

5. Un sistema de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el gen se modifica para casi seguir parcialmente el uso de un codón en una especie en la que el sistema es para su uso.

6. Un sistema de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el primer y/o el segundo promotores están sustancialmente inactivos en ausencia del factor de control de transcripción positivo.

7. Un sistema de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el primer y/o el segundo promotores mínimos de insecto se seleccionan de entre: hsp70, un promotor mínimo P, un promotor mínimo basado en Act5C, un fragmento del promotor BmA3, un promotor core Adh y un promotor Act5C, o combinaciones de los mismos.

8. Un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer y/o el segundo promotores mínimos se derivan de, o son un fragmento de, Hsp70.

9. Un sistema de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que reduce la aptitud biológica cuando se deja de reprimir.

10. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende un gen letal bajo el control de un promotor del sistema.

11. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el gen letal es un gen letal dominante.

12. Un sistema de acuerdo con las reivindicaciones 10 u 11, en el que el gen letal y el gen de factor de control son el mismo.

13. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el gen es tTA o un análogo del mismo.

14. Un sistema de acuerdo con las reivindicaciones 10 u 11, en el que el gen letal y el gen factor de control son diferentes.

15. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la reducción de la aptitud biológica es una alta tasa de mortalidad.

16. Un sistema de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la expresión del gen de factor de control es selectiva.

17. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la expresión del gen de factor de control está determinado por el sexo.

18. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 17, que comprende una secuencia letal de sexo doble, transformación o específica del sexo.

19. Un sistema de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el gen de interés está unido operativamente a al menos un promotor mínimo de insecto.

20. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el gen de interés es un gen letal dominante.

21. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el gen de interés codifica ARNi.

22. Un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en el que la activación del promotor mínimo de insecto al que está unido operativamente el gen de interés da lugar a un efecto selectivo por medio de un producto de transcripción o de traducción de ADN bajo el control del promotor mínimo de insecto.

23. Un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, en el que la selección es específica de la especie.

24. Un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que la selección es específica del estadio de desarrollo.

25. Un sistema de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que es al menos dos cistrones, estando dichos cistrones unidos a un potenciador bajo el control del gen de factor de control.

26. Un sistema de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que al eliminarse un supresor del gen la expresión del gen de factor de control no tiene sustancialmente ningún efecto sobre la aptitud biológica del adulto en el que se ha eliminado el supresor.

27. Un sistema de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, limitado por elementos aisladores.

28. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 27, en el que los aisladores son aisladores no idénticos.

29. pLA513 tal como se identifica por la SEC ID Nº 16.

30. JY2004-tTA tal como se identifica por la SEC ID Nº 14.

31. Un vector que comprende el sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.

32. Un vector de acuerdo con la reivindicación 31, que comprende además un marcador de expresión.

33. Un vector de acuerdo con la reivindicación 32, en el que el marcador de expresión es una proteína fluorescente o un marcador de resistencia.

34. Un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, que comprende además un gen de transposasa que se puede expresar.

35. Un insecto que comprende, en su genoma, un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.

36. Un insecto de acuerdo con la reivindicación 35, que sustancialmente no está amenazado por el sistema bajo condiciones tolerantes cuando el gen factor de control no se expresa.

37. Un insecto de acuerdo con las reivindicaciones 35 o 36 que forma parte de una especie dañina.

38. Un insecto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, que se selecciona de entre: mosquito, gusano rosado, mosca mediterránea de la fruta y Drosophila.

39. Un insecto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, en el que la expresión del gen de factor de control es bloqueable o controlable por medio de suplementos de la dieta.

40. Un procedimiento para establecer la compatibilidad de un promotor mínimo de insecto con una especie de insecto, que comprende:

1) Transformar dicha especie con un plásmido, u otro vector, comprendiendo el plásmido o el otro vector:

- un sistema, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, que incluye el promotor mínimo de insecto que hay que ensayar unido operativamente al gen de interés de dicho sistema; y

- un marcador de transformación, bajo el control de un promotor de marcador de insecto apropiado a dicha especie:

2) Ensayar la expresión del marcador de los individuos transgénicos putativos; y 3) Ensayar la expresión del gen de interés en los individuos que expresan el marcador.

41. El uso del sistema de expresión génica de insectos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-14 en el control de una población de insectos dañinos.