SISTEMA PARA MEJORAR LA PRODUCCIÓN DE POLIHIDROXIALCANOATOS (BIOPLÁSTICO) POR FERMENTACIÓN A PARTIR DE GLICEROL UTILIZANDO UNA CEPA DE PSEUDOMONAS PUTIDA MODIFICADA GENÉTICAMENTE.

Sistema para mejorar la producción de polihidroxialcanoatos (bioplástico) por fermentación a partir de glicerol utilizando una cepa de pseudomonas putida modificada genéticamente.

En la presente invención se describe el diseño y realización de un procedimiento para facilitar la producción de sustancias, y en particular de polihidroxialcanoatos (PHAs), en Pseudomonas putida a partir de glicerol. A tal fin se ha construido una cepa mutante derivada de P. putida portadora de una mutación en el cromosoma del gen glpR que permite que la bacteria pueda utilizar el glicerol como fuente de carbono y energía de una manera más eficiente y por lo tanto permite mejorar la producción de biomasa y de sustancias a partir de glicerol como por ejemplo mejorar la producción de los gránulos de PHA reduciendo a la mitad el tiempo de producción.

SISTEMA PARA MEJORAR LA PRODUCCiÓN DE POLlHIDROXIALCANOATOS (BIOPLÁSTICO) POR FERMENTACiÓN A PARTIR DE GLICEROL UTILIZANDO UNA CEPA DE Pseudomonas pUlida MODIFICADA GENÉTICAMENTE.

SECTOR DE LA TÉCNICA La presente invención se encuadra dentro del Área de la Biotecnologia Industrial en el sector de la Industria Ouimica, y en particular de la denominada Ouimica Sostenible o Quimica Verde, pudiendo afectar tanto al subsector de las sustancias químicas primarias como al subsector de las sustancias químicas especializadas. El sistema desarrollado para Pseudomonas pUlida hace que sea aplicable a la producción de cualquier sustancia por fermentación en este microorganismo, pero especialmente para la biosíntesis de polihidroxialcanoatos (PHAs) .

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR La tecnología de los bioprocesos ha experimentado en los últimos años un avance considerable tratando de mejorar y adaptar la moderna biotecnología a las tecnologias clasicas de fermentación. En este sentido, la tecnologia del DNA

recombinante o, en un concepto más amplio, las técnicas de biología molecular,

han sido determinantes para que podamos explotar y manipular un gran número de organismos para la producción de sustancias de interés. En gran medida, este éxito ha sido posible gracias al desarrollo de sistemas para expresión de genes en organismos heterólogos mas faciles de manipular y multiplicar. Dentro de las diferentes opciones que se pueden estud iar, cabe destacar aquéllas que no sólo pretenden la expresión de un gen o conjunto de genes sino que, ademas, tratan de facilitar la obtención de un producto de interés biotecnológico y de alto valor añadido, como es el bioplastico. Sin embargo, el uso de este tipo de biopolimeros no se ha implantado hasta ahora en el mercado de forma competitiva debido al bajo coste que aún mantiene la sintesis de los poli meros plásticos derivados del petróleo (Prieto el al. (2007) Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Model Syslem in Biology. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos,

J. L. Y Filloux, A. Springer. 397-428) . Actualmente, como consecuencia del problema de contaminación medioambiental que ha generado el uso del plástico convencional y el incremento del precio del petróleo, se está haciendo una apuesta clara por la implantación de procesos de tipo sostenible para la obtención de energia y la producción de materiales de alto consumo como son los biopolimeros plásticos, y en particular los polihidroxialcanoatos (PHAs) (Gavrilescu y Chisti (2005) . Biolechn%gy Advances 23: 471-499) .

Los PHAs, conocidos comúnmente como "bioplásticos", son polímeros biodegradables producidos por ciertas bacterias, que se acumulan en el interior celular en forma de gránulos de reserva de fuente de carbono cuando las condiciones de cultivo no son óptimas para el crecimiento (revisado en Madison y Huisman (1999) Microbio/. Mo/. Bio/. Rev. 63: 21-53; Prieto el al. (2007) Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Mode/ System in Bi%gy. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. Y Filloux, A. Springer. 397-428) . Estos biopolimeros son biodegradables y las bacterias los sintetizan a partir de fuentes renovables como por ejemplo la glucosa, la fructosa o los ácidos grasos que forman parte de los aceites vegetales (Prieto et al. (2007) Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Mode/ System in Bi%gy. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. Y Filloux, A. Springer. 397-428) . Por tanto, se puede definir el término bioplástico como biopolímero sintetizado a partir de fuentes renovables, que puede ser biodegradado en condiciones controladas y que presenta características físico-químicas similares a los plásticos derivados de la industria petroleoquimica (Sarasa el al. (2009) Bioresour. Techno/.

100: 3764-3768.) .

En general, los gránulos de PHA están compuestos por un poliéster (9397% del peso seco del gránulo (PSG) rodeado por fosfolipidos (1-6% del PSG) y proteinas asociadas al gránulo (GAPs) (1-2% del PSG) , las cuales forman una fina capa en la superficie del gránulo (Steinbüchel el al. (1995) Can. J. Microbio/.

41: 94-105) . Hasta el momento se han definido tres clases de GAPs en bacterias: i) las PHA sintasas, involucradas en la polimerización del PHA, ii) las PHA despolimerasas, responsables de la degradación del bioplástico y iii) las fasinas, las GAPs más abundantes, con una función estructural o reguladora (Prieto el al. (1999a) App/. Environ. Microbio/. 65: 3265-3271 ; Moldes el al. (2004) App/. Environ. Microbio/. 70: 3205-3212) . La presencia de una monocapa fosfolipidica en la superficie del gránulo es consecuente con la naturaleza hidrofóbica del PHA, ya que confiere estabilidad al gránulo inmerso en el ambiente hidrofílico del citoplasma celular (de Smet et al. (1983) . J. Bacteriol. 154: 870-878) .

Los PHAs se clasifican en dos tipos principales de acuerdo a su estructura quimica: los PHAs de cadena corta (scl-PHAs) obtenidos a partir de monómeros con 4 o 5 átomos de carbono y los de cadena media (mcl-PHAs) procedentes de monómeros con 6 a 14 átomos de carbono. Los diferentes PHAs identificados hasta la fecha son poli meros lineales compuestos de 3-hidroxiácidos grasos exclusivamente de la configuración R. El peso molecular de estos polímeros varía entre 50.000-1.000.000 y su diversidad radica en las sustituciones en el carbono asimétrico en posición 3, que le confiere al polímero el carácter quira l. El biopoliéster está formado únicamente por la forma enantiomérica R de los hidroxialcanoatos (RHA) (Prieto et al. (1999b) J. Bacteriol. 181: 858-868) . Los mcl-PHA producidos por el género Pseudomonas están compuestos mayoritariamente por monómeros de ácido hidroxioctanoico, pero también se pueden encontrar en menor porcentaje una gran diversidad de monómeros que contienen como sustituyentes grupos aromáticos, alifáticos, insaturados,

saturados, con ramificaciones, etc. (Steinbüchel et al. (1995) Can. J. Microbiol. 41: 94-105; Garcia et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 29228-29241 ; Prieto et al. (2007) Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Model System in Biology. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. Y Filloux, A. Springer. 397-428) . Esto es debido principalmente a la gran diversidad metabólica que caracteriza a estos microorganismos ya que pueden transformar una gran variedad de sustratos en intermediarios 3-hidroxialcanoicos mediante la ruta de ~

oxidación y de sintesis de novo de ácidos grasos (Madison y Huisman (1999) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63: 21-53; Prieto et al. (2007) Synthesis and degradation 01 polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Model System in Bio/ogy. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. Y Filloux, A. Springer. 397-428) .

Se sabe que la composición del poli mero depende de la fuente de carbono presente en el medio de cultivo utilizado durante la fermentación de la bacteria productora (Dumer, et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 72: 278-288; Jung et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 72:19-24) . Por otra parte, es importante resaltar que las caracteristicas fisico-quimicas de los polimeros varian según la naturaleza química de los monómeros que los componen (Madison y Huisman (1999) Microbiol. Mol. Bio/. Rev. 63: 21-53; Kessler y Witholt (2001) J. Biotechnol. 86: 97104) . Teniendo en cuenta que se han descrito más de 140 RHAs diferentes en PHAs producidos por bacterias (Steinbüchel el al. (1995) Can. J. Microbiol. 41: 94-105; Sudesh et al. (2000) Prag. Polym. Sci. 25: 1503-1555) , y que el biopolímero después de su obtención por fermentación puede ser sometido a posteriores modificaciones químicas, como a su entrecruzamiento y a la adición de grupos funcionales (Lageveen el al. (1988) Appl. Enviran. Microbiol. 54: 29242932) es fácil imaginar la gran diversidad de bioplásticos y RHAs diferentes que pueden generarse mediante la combinación de todos estos procesos. Es importante señalar que los PHAs también pueden ser útiles para aplicaciones biomédicas como biomateriales (Zinn el al. (2001) Adv. Drug. Defiv. Rev. 53:5-21) . Además, el PHA puede ser considerado como una fuente de nuevos compuestos quirales (sintones) de gran utilidad como precursores en la industria farmacéutica , ya que son difíciles de conseguir en estado puro mediante procesos químicos convencionales.

La bacteria Pseudomonas putida KT2440 es una cepa productora de mcl-PHA que posee unas excelentes características para ser utilizada en la producción de bioplásticos a escala industrial ya que, además de su gran diversidad metabólica, esta bacteria está certificada como bacteria GRAS (Gene rally Recognized As Safe) por la American Food and Drug Administration (FDA) para ser utilizada en... [Seguir leyendo]

. Una cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 para la producción de bioproductos a partir de glicerol como única fuente de carbono, caracterizada por que en el gen G/pRcon SEO ID No. 2, comprende un mutación de pérdida de

función .

2. La cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 según la reivindicación 1, caracterizada por que dichos bioproductos son bioplásticos.

3. La cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 según la reivindicación 2, caracterizada por que dichos bioplásticos son

polihidroxialcanoatos.

4. La cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 según la reivindicación 3, caracterizada porque dichos polihidroxialcanoatos son met·

polihidroxialcanoatos.

5. La cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que dicha mutación de pérdida de lunción es una deleción.

6. La cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 según la reivindicación 5, caracterizada por que la deleción es parcial o total.

7. La cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que es la cepa Pseudomonas pulida KT 40GlpR, depositada el 18 de octubre de 2011 en la Colección Española de Cultivos Tipo {CECT) y cuya referencia es 8037.

8. Uso de la cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la producción de bioproductos

mediante fermentación a partir de glicerol como única fuente de carbono.

9. Uso de la cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 según la reivindicación 8, caracterizada por que dichos bioproductos son bioplásticos_

10. Uso de la cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 según la reivindicación 9, caracterizada por que dichos bioplásticos son polihidroxialcanoatos.

. Uso de la cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 según la reivindicación 10, caracterizada por que dichos polihidroxialcanoatos son mclpolihidroxialcanoatos.

12. Un método de producción de bioproductos que comprende las siguientes elapas: a) añadir a un medio con glicerol como única fuente de carbono, la cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,

b) fermentación del glicerol y obtención de los bioproductos.

13. El método de producción de bioproductos según la reivindicación 12,

caracterizada por que dichos bioproductos son bioplásticos.

14. El método de producción de bioproductos según la reivindicación 13,

caracterizada por que dichos bioplásticos son polihidroxialcanoatos.

15. El método de producción de bioproductos según la reivindicación 14, caracterizada por que dichos polihidroxialcanoatos son mcl-polihidroxialcanoatos.

16. El método de producción de bioproductos según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizado por que el medio con glicerol como única fuente de carbono descrito en a) se obtiene de residuos de biod iesel.

17. Un bioproducto obtenido mediante fermentación a parti r de glicerol como

única fuente de carbono, caracterizado por que dicha fermentación la realiza una 26

cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 definida en cualquiera de las

reivindicaciones 1 a 7.

18. El bioproducto obtenido mediante fermentación a partir de glicerol como única fuente de carbono según la reivindicación 17, caracterizado por que dicho bioproducto es un bioplástico.

19. El bioproducto obtenido mediante fermentación a partir de glicerol como única fuente de carbono según la reivindicación 18, caracterizado por que dicho 10 bioplástico es un polihidroxialcanoato.

20. El bioproducto obtenido mediante fermentación a partir de glicerol como única fuente de carbono según la reivindicación 19, caracterizado por que dicho polihidroxialcanoato es un mct-polihidroxialcanoato. 15

21. El bioproducto obtenido mediante fermentación a partir de glicerol como única fuente de carbono según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, para su uso como biomaterial en aplicaciones biomédicas.

22. El bioproducto obtenido mediante fermentación a partir de glicerol como única fuente de carbono según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, para su uso como fuente de nuevos compuestos quirales como precursores en la industria farmacéutica.