Sistema libre de productos de origen animal y procedimiento de purificación de una toxina botulínica.

Un procedimiento libre de proteínas de origen animal (APF) de producción de una toxina purificada de Clostridiumbotulinum A,

B o F que comprende las etapas de:

(a) producir un cultivo de fermentación de Clostridium botulinum utilizando un medio de cultivo libre de proteínasde origen animal, comprendiendo el medio soja hidrolizada;

(b) obtener una muestra del cultivo de fermentación de Clostridium botulinum;

(c) poner en contacto una resina de columna de interacción hidrófoba con la muestra de cultivo para permitir lacaptura de una toxina botulínica por la columna de interacción hidrófoba;

(d) eluir la toxina botulínica de la columna de interacción hidrófoba;

(e) cargar una resina de columna de intercambio iónico con el eluyente de la columna de interacción hidrófoba; y

(f) eluir la toxina botulínica de la columna de intercambio iónico; obteniendo de esta manera una toxina botulínicaA, B o F purificada.

Sistema libre de productos de origen animal y procedimiento de purificación de una toxina botulínica Referencia cruzada La presente solicitud es una continuación en parte de la solicitud de patente de Estados Unidos con número de serie pendiente, presentada el 3 de marzo de 2005, titulada “Medios para bacteria Clostridium y procedimientos para la obtención de una toxina de Clostridium” de Ping Wang y Stephen Donovan, que es una continuación en parte de la solicitud de Estados Unidos con número de serie 10/672.876, presentada el 25 de septiembre de 2003.

Antecedentes La presente invención se refiere a sistemas y procedimientos de purificación de una toxina de Clostridium. En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento cromatográfico de purificación de una neurotoxina botulínica. Una composición farmacéutica adecuada para su administración a un ser humano o un animal con un propósito terapéutico, diagnóstico, de investigación o cosmético, puede comprender un principio activo. La composición farmacéutica también puede incluir uno o más excipientes, tampones, vehículos, estabilizantes, conservantes y/o agentes para aumentar el volumen. El principio activo en una composición farmacéutica puede ser biológico tal como una toxina botulínica. La toxina botulínica como principio activo utilizado para fabricar una composición farmacéutica de toxina botulínica se puede obtener a través de un procedimiento multietapa de cultivo, fermentación y preparación de compuestos que utiliza uno o más productos de origen animal (tales como caldo de carne e ingredientes de caseína en uno o más de los medios de cultivo y fermentación usados para obtener una toxina botulínica a granel, y una fracción de sangre o un excipiente derivado de sangre en la preparación final de la composición farmacéutica de toxina botulínica) . La administración a un paciente de una composición farmacéutica en la que el principio activo biológico se obtiene a través de un procedimiento que utiliza productos de origen animal puede someter al paciente al posible riesgo de recibir varios agentes patógenos o infecciosos. Por ejemplo, en una composición farmacéutica pueden estar presentes priones. Un prión es una partícula infecciosa proteica de la que se ha hipotetizado que aparece como una isoforma conformacional anormal a partir de la misma secuencia de ácido nucleico que produce la proteína normal. También se ha propuesto la hipótesis de que la infectividad reside en una “reacción de reclutamiento” de la isoforma normal de la proteína hacia la isoforma priónica de la proteína en un nivel postraduccional. Aparentemente, la proteína normal celular endógena es inducida a plegarse erróneamente en la conformación patogénica priónica.

La enfermedad de Creutzfeldt-Jacob es un raro trastorno neurodegenerativo de encefalopatía espongiforme transmisible humana en la que el agente transmisor es aparentemente una isoforma anormal de una proteína priónica. Un individuo con la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob puede deteriorarse en seis meses de una apariencia perfectamente sana a mutismo acinético. Por tanto, puede existir un riesgo potencial de adquirir una enfermedad mediada por priones, tal como la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, por la administración de una composición farmacéutica que contenga un producto biológico, tal como una toxina botulínica, obtenida, purificada o compuesta utilizando productos de origen animal.

Toxina botulínica El género Clostridium tiene más de ciento veintisiete especies, agrupadas por su morfología y función. La bacteria anaerobia gram positiva Clostridium botulinum produce una potente neurotoxina polipeptídica, la toxina botulínica, que causa una enfermedad neuroparalítica en seres humanos y en animales llamada botulismo. El Clostridium botulinum y sus esporas se encuentran comúnmente en el suelo y las bacterias pueden crecer en envases de comida inadecuadamente esterilizados y sellados de conservas de tipo casero, que son la causa de muchos de los casos de botulismo. Los efectos del botulismo aparecen típicamente de 18 a 36 horas después de haber comido los alimentos infectados con un cultivo de Clostridium botulinum o sus esporas. La toxina botulínica puede pasar aparentemente sin atenuar a través del revestimiento del intestino y atacar a las neuronas motoras periféricas. Los síntomas de la intoxicación por toxina botulínica pueden progresar desde una dificultad para caminar, tragar, y hablar a una parálisis de los músculos respiratorios y muerte.

La toxina botulínica tipo A es el agente biológico natural más letal conocido para el hombre. Aproximadamente 50 picogramos de toxina botulínica (complejo de neurotoxina purificada) tipo A es una DL50 en ratones. En base molar, la toxina botulínica tipo A es 1, 8 mil millones de veces más letal que la difteria, 600 millones de veces más letal que el cianuro sódico, 30 millones de veces más letal que la cobrotoxina y 12 millones de veces más letal que el cólera. Singh, Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, páginas 63-84 (capítulo 4) of Natural Toxins II, editado por B.R. Singh y col., Plenum Press, New York (1976) (donde la afirmación de que la DL50 de toxina botulínica tipo A de 0, 3 ng equivale a 1 U se corrige por el hecho de que aproximadamente 0, 05 ng de BOTOX® es igual a 1 unidad) . El BOTOX® es la marca registrada de un complejo de neurotoxina de toxina botulínica tipo A purificada disponible comercialmente en Allergan, Inc., de Irvine, California. Una unidad (U) de toxina botulínica se define como la DL50 tras la inyección intraperitoneal en ratones hembra Swiss Webster que pesen aproximadamente 18-20 gramos cada uno. En otras palabras, una unidad de toxina botulínica es la cantidad de toxina botulínica que mata el 50% de un grupo de ratones hembra Swiss Webster. Se han caracterizado de manera general siete neurotoxinas botulínicas

distintas inmunológicamente, estas son respectivamente los serotipos de neutoroxina botulínica A, B, C1, D, E, F y G, cada una de las cuales se distingue por neutralización con anticuerpos específicos de tipo. Los diferentes serotipos de toxina botulínica varían en las especies animales a las que afectan y en la gravedad y duración de la parálisis que causan. Por ejemplo, se ha determinado que la toxina botulínica tipo A es 500 veces más potente, cuando se mide por la tasa de parálisis que produce en la rata, que la toxina botulínica tipo B. Además, se ha determinado que la toxina botulínica tipo B no es tóxica para los primates a una dosis de 480 U/kg que es aproximadamente 12 veces la DL50 en primates para la toxina botulínica tipo A. Las toxinas botulínicas aparentemente se unen con alta afinidad a las neuronas motoras colinérgicas, se translocan a las neuronas y bloquean la liberación presináptica de acetilcolina.

Las toxinas botulínicas se han utilizado en el contexto clínico para el tratamiento de, por ejemplo, trastornos musculares caracterizados por músculos esqueléticos hiperactivos. La toxina botulínica tipo A se ha aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos para el tratamiento del blefaroespasmo esencial, el estrabismo y el espasmo hemifacial en pacientes de más de doce años, para el tratamiento de la distonía cervical y para el tratamiento de las arrugas de la línea glabelar (facial) . La FDA ha aprobado también una toxina botulínica del tipo B para el tratamiento de la distonía cervical. Los efectos clínicos de la inyección periférica (es decir, intramuscular o subcutánea) de toxina botulínica tipo A se ven usualmente en la semana posterior a la inyección, y a menudo en pocas horas tras la inyección. La duración típica del alivio sintomático (es decir, de la parálisis muscular flácida) por una sola inyección intramuscular de toxina botulínica tipo A puede ser de aproximadamente tres meses a aproximadamente seis meses.

Aunque todos los serotipos de toxina botulínica aparentemente inhiben la liberación del neurotransmisor acetilcolina en la unión neuromuscular, lo hacen afectando a distintas proteínas neurosecretoras y/o escindiendo estas proteínas en diferentes sitios. La toxina botulínica A es una endopeptidasa de cinc que puede hidrolizar específicamente un enlace peptídico de la proteína SNAP-25 intracelular, asociada a vesículas. La toxina botulínica tipo E también escinde la proteína asociada al sinaptosoma de 25 kiloDaltons (kDa) (SNAP-25) , pero se dirige a diferentes secuencias de aminoácidos en esta proteína, cuando se compara con la toxina botulínica tipo A. Los tipos de toxina botulínica B, D, F y G actúan sobre la proteína asociada a vesículas (VAMP, también llamada sinaptobrevina) , y cada serotipo escinde la proteína... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento libre de proteínas de origen animal (APF) de producción de una toxina purificada de Clostridium botulinum A, B o F que comprende las etapas de:

(a) producir un cultivo de fermentación de Clostridium botulinum utilizando un medio de cultivo libre de proteínas de origen animal, comprendiendo el medio soja hidrolizada;

(b) obtener una muestra del cultivo de fermentación de Clostridium botulinum;

(c) poner en contacto una resina de columna de interacción hidrófoba con la muestra de cultivo para permitir la captura de una toxina botulínica por la columna de interacción hidrófoba;

(d) eluir la toxina botulínica de la columna de interacción hidrófoba;

(e) cargar una resina de columna de intercambio iónico con el eluyente de la columna de interacción hidrófoba; y

(f) eluir la toxina botulínica de la columna de intercambio iónico; obteniendo de esta manera una toxina botulínica A, B o F purificada.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende, después de la etapa de puesta en contacto (c) y antes de la etapa de elución (d) , la etapa de retirada por lavado de impurezas de la columna de interacción hidrófoba.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que además comprende, después de la etapa de carga (e) y antes de la etapa de elución (f) , la etapa de retirada por lavado de impurezas de la columna de intercambio iónico.

4. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el rendimiento de toxina botulínica purificada es mayor de 50 mg por lote para cada 10 litros de cultivo de fermentación de Clostridium botulinum.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que:

(i) las impurezas se retiran por lavado de la columna de interacción hidrófoba antes de la etapa de elución (d) ; y

(ii) las impurezas se retiran por lavado de la columna de cromatografía de intercambio iónico antes de la etapa de elución (f) .

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, que además comprende, después de la etapa de obtención de una muestra de cultivo de fermentación de Clostridium botulinum y antes de la etapa de puesta en contacto de la resina de la columna de cromatografía de interacción hidrófoba con la muestra de cultivo, la etapa de acondicionamiento del cultivo para la cromatografía de interacción hidrófoba.

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, que además comprende, después de la etapa de elución de la toxina botulínica de la columna de interacción hidrófoba y antes de la etapa de carga de este eluyente en la columna de cromatografía de intercambio iónico en columna, la etapa de acondicionamiento del eluyente de la columna de interacción hidrófoba para la cromatografía de intercambio iónico.