SINTESIS DE POLIHIDROXIALCANOATOS (PHA) CON GRUPOS TIOESTERES EN LA CADENA LATERAL.

Síntesis de polihidroxialcanoatos (PHA) con grupos tioésteres en la cadena lateral.



La presente invención se refiere a un proceso de síntesis de polihidroxialcanoatos (PHA), a los PHA obtenidos mediante este proceso y al uso de dichos PHA. Los PHA de la presente invención, denominados PHACOS, tienen una composición monomérica nueva, ya que contienen monómeros con grupos tioéster en la cadena lateral que les confieren nuevas propiedades físico-químicas y permiten su posterior modificación química.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201031401.

Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: GARCIA LOPEZ,JOSE LUIS, PRIETO JIMENEZ,M. AUXILIADORA, FERNÁNDEZ ESCAPA,Isabel, MORALES RUIZ,Mª del Valle.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N1/20 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Bacterias; Sus medios de cultivo.
  • C12P7/62 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › Esteres de ácidos carboxílicos.

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Fragmento de la descripción:

Síntesis de polihidroxialcanoatos (PHA) con grupos tioésteres en la cadena lateral

La presente invención se refiere a un nuevo proceso para la síntesis de polihidroxialcanoatos (PHA) y a los PHA obtenidos mediante dicho proceso. Además, la presente invención se refiere al uso de dichos PHA. Por tanto, la presente invención pertenece al campo de la Biotecnología Medioambiental, al de la Microbiología y al de los Biopolímeros.

ESTADO DE LA TECNICA

Los polihidroxialcanoatos (PHA) , conocidos comúnmente como “bioplásticos”, son polímeros biodegradables producidos por ciertas bacterias, que se acumulan en el interior celular en forma de gránulos de reserva de fuente de carbono cuando las condiciones de cultivo no son óptimas para el crecimiento (Madison y Huisman, 1999. Microbiol. Mol. Bio l. Rev., 63: 21-53) . Estos biopolímeros son biodegradables y las bacterias los sintetizan a partir de fuentes renovables como por ejemplo la glucosa, la fructosa o los ácidos grasos que forman parte de los aceites vegetales. Por tanto, se puede definir el término bioplástico como biopolímero sintetizado a partir de fuentes renovables, que puede ser biodegradado en condiciones controladas y que presenta características físico-químicas similares a las de los plásticos derivados de la industria petroleoquímica (Sarasa et al., 2009. Bioresour. Technol. 100: 3764–3768) .

En general, los gránulos de PHA están compuestos por un poliéster (93-97% del peso seco del gránulo (PSG) ) rodeado por fosfolípidos (1-6% del PSG) y proteínas asociadas al gránulo (GAP, del inglés “Granule associated proteins”) (1-2% del PSG) , las cuales forman una fina capa en la superficie del gránulo. Hasta el momento se han definido tres clases de GAP en bacterias: i) las PHA sintasas, involucradas en la polimerización del PHA, ii) las PHA despolimerasas, responsables de la degradación del bioplástico y iii) las fasinas, las GAPs más abundantes, con una función estructural

o reguladora (Prieto et al. 1999a. Appl. Environ. Microbiol., 65: 3265-3271; Moldes et al., 2004. Appl. Environ. Microbiol.,

70: 3205-3212) .

Los PHA se clasifican en dos tipos principales de acuerdo a su estructura química: los PHA de cadena corta (scl-PHA, del inglés “short chain length PHA”) obtenidos a partir de monómeros con 4 ó 5 átomos de carbono y los de cadena media (mcl-PHAs del inglés "medium c hain length P HA”) procedentes de monómeros con entre 6 y 14 átomos de carbono. Los diferentes PHA identificados hasta la fecha son polímeros lineales compuestos de 3-hidroxiácidos grasos exclusivamente de la configuración R (RHA) . El peso molecular de estos polímeros varía entre 50.000-1.000.000 y su diversidad radica en las sustituciones en el carbono asimétrico en posición 3, que le confiere al polímero el carácter quiral (Prieto et al., 1999 J. Bacteriol. 181: 858-868) .

Es conocido que la composición del polímero depende de la fuente de carbono presente en el medio de cultivo utilizado durante la fermentación de la bacteria productora (Durner, et al., 2001. Biotechnol. Bioeng., 72: 278-288, Jung et al., 2001. Biotechnol. Bioeng., 72: 19-24) . Por otra parte, es importante resaltar que las características físico-químicas de los polímeros varían según la naturaleza química de los monómeros que los componen (Kessler et al., 2001. J. Biotechnol.,

86: 97-104) . Teniendo en cuenta que se han descrito más de 140 RHA diferentes como componentes de los PHA producidos por bacterias (Steinbüchel et al., 1995. Can. J. Microbiol., 41: 94-105) , y que el biopolímero después de su obtención por fermentación puede ser sometido a posteriores modificaciones químicas, tales como el entrecruzamiento y a la adición de grupos funcionales (Lageveen et al., 1988. Appl. Environ. Microbiol., 54: 2924-2932.) , es fácil imaginar la gran diversidad de bioplásticos y RHA diferentes que pueden generarse mediante la combinación de todos estos procesos.

Dado que los PHA son biopoliésteres bacterianos no tóxicos, biodegradables y biocompatibles producidos por una amplia gama de bacterias, incluyendo Pseudomonas (P.) , estos compuestos tienen mucho potencial en aplicaciones biomédicas y farmacéuticas, debido a su posible uso como biomateriales y a su aplicación en sistemas de liberación controlada de fármacos y en la ingeniería de tejidos. Los PHA también han atraído considerable atención debido a su potencial uso como fuentes de monómeros quirales o sintones, que son de gran utilidad como precursores en la industria farmacéutica, ya que son difíciles de conseguir en estado puro mediante los procesos químicos convencionales. Las propiedades físico-químicas de los PHA abarcan desde rígido y cristalino a lo flexible, amorfo y elastomérico, en función de su composición monómerica y de la longitud de la cadena lateral del polímero.

Se han descrito muchos PHA con grupos funcionales en sus cadenas laterales, tales como bromo, cloro, flúor, un grupo alquilo ramificado, un grupo ciano, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi, un grupo acetoxi, un grupo epoxi, un grupo ciclohexilo, un grupo feniltio y un grupo propiltio (Kim et al., 2007. The Journal of Microbiology. 45, 2, 87-97) . Estos dos últimos son los únicos ejemplos de PHA que contienen azufre en la cadena lateral. Los PHA con un grupo tiofenoxi en la cadena lateral se obtuvieron de P. puti da 27N01 empleando ácido 11-tiofenoxi-undecanoico como única fuente de carbono (Takagi et al., 1999. Macromolecules 32, 8315-18) . Los PHA con un grupo propiltio en su cadena lateral se componen de monómeros de ácido hydroxipropiltioalcanoico. También se han sintetizado PHA que contienen tioéteres en la cadena lateral mediante una cepa recombinante de Ralstonia eutrop ha mutante para la producción de polihidroxibutirato y para expresar la enzima PHA sintasa de P. mendocina, empleando como sustrato ácido propiltiooctanoico o ácido propiltiohexanoico (Ewering et al., 2002. Microbiology 148, 1397-1406) . Esta cepa sintetiza a partir de ácido propiltiooctanoico el terpoliéster compuesto por ácido 3-hydroxipropiltiobutírico, ácido 3hidroxipropiltiohexanoico y ácido 3-hidroxipropiltiooctanoico, y a partir del ácido propilthiohexanoico, sintetiza el poliéster de 3-hydroxipropiltiobutírico y ácido 3-hidroxipropiltiohexanoico. Todos estos PHA contienen grupos tioéter en las cadenas laterales, pero no se conocen PHA que contengan tioésteres en la cadena lateral.

La síntesis de nuevos PHA sigue siendo de gran interés ya que los nuevos biopolímeros, así como los monómeros que los componen, con nuevas propiedades físico-químicas, tienen potencialmente una enorme utilidad para la industria.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a un proceso de síntesis de polihidroxialcanoatos (PHA) , a los PHA obtenidos mediante este proceso y al uso de dichos PHA. Los PHA de la presente invención, denominados PHACOS, tienen una composición monomérica nueva, ya que contienen monómeros con grupos tioéster en la cadena lateral que les confieren nuevas propiedades físico-químicas, como por ejemplo (i) una elevada constante de transición vítrea respecto a los PHA convencionales, (ii) una carencia de punto de fusión, ya que son completamente amorfos, y (iii) que permiten su posterior modificación química. El grupo tioéster en la cadena lateral de los PHACOS supone la ventaja de que facilita su modificación química, lo cual implica que el PHA modificado tendrá unas nuevas propiedades, que proporcionan nuevas aplicaciones y/o mejoras en las mismas. Por ejemplo, el grupo tioéster de la cadena lateral permite la unión de los PHACOS a péptidos u otras moléculas.

Los monómeros de los PHACOS son ácidos (R) -3-hidroxi-aciltioalcanoicos, como el ácido (R) -3-hidroxi-6acetiltiohexanoico o el (R) -3-hidroxi-4-acetiltiobutanoico. Estos monómeros pueden ser fácilmente modificados químicamente, por lo que son muy valiosos para su uso en la industria farmacéutica como sintones. La presente invención describe también un método de obtención de estos (R) -3-hidroxi-aciltioalcanoicos enantiopuros, a partir de los PHACOS.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la síntesis de polihidroxialcanoatos (PHA) que implica cultivar una célula capaz de producir PHA en un sustrato, donde dicho sustrato comprende al menos un compuesto alifático funcionalizado con un grupo tioéster.

La célula puede ser, pero sin limitarse, una célula vegetal, una levadura o una bacteria. La célula vegetal o la levadura pueden estar modificadas genéticamente, es decir, pueden ser células recombinantes.

Preferiblemente, la célula es una... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para la síntesis de polihidroxialcanoatos (PHA) que comprende cultivar una célula del género Pseudomonas capaz de producir PHA en un sustrato, donde dicho sustrato comprende al menos un cosustrato y un compuesto alifático funcionalizado con un grupo tioéster.

2. El procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado porque la bacteria se selecciona de la lista que comprende: P. putida KT2442, P. putida U, P. oleovorans GPo1, P. putida KT42FadB (CECT 7772) y P. putida U fFadBA.

3. El procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado porque la bacteria es P. putida KT42FadB (CECT 7772) .

4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque el compuesto alifático funcionalizado es un ácido aciltioalcanoico que se selecciona de la lista que comprende los siguientes ácidos: 6acetiltiohexanoico, 5-acetiltiopentanoico, 2, 5-bis (acetilsulfanil) pentanoico, 4-acetiltiolbutanoico, 3acetilsulfanilbutanoico, 11-acetiltioundecanoico, 16-acetilhiolhexadecanoico, 5-acetiltiooctanoico, 5propanoyiltiooctanoico, 5-butanoiltiooctanoico, 12-acetiltiododecanoico, 6-acetilsulfanil-8-metilsulfaniloctanoico, 8acetilsulfanil-6-sulfaniloctanoico, 5- (2-metilpropanoilsulfanil) octanoico, 6, 8-bis (acetilsulfanil) octanoico.

5. El procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado porque el compuesto alifático funcionalizado es el ácido 6-acetiltiohexanoico.

6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque el cosustrato además comprende un compuesto alifático.

7. El procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado porque el compuesto alifático es un ácido graso de entre 4 y 28 carbonos.

8. El procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado porque el ácido graso se selecciona de la lista que comprende: ácido decanoico, ácido nonanoico y ácido octanoico.

9. El procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado porque el compuesto alifático es el ácido decanoico.

10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque el sustrato comprende ácido decanoico y ácido 6-acetiltiohexanoico.

11. El procedimiento según cualquiera de las cinco reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el sustrato comprende una relación molar del compuesto alifático y compuesto alifático funcionalizado con un grupo tioéster de entre 1:9 a 9:1.

12. El procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado porque la relación es de entre 1, 1:8, 9 a 2:8.

13. El procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado porque la relación es de entre 1, 5:8, 5 y 1, 8:8, 2.

14. El procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado porque el sustrato consiste en ácido decanoico 2, 4 mM y ácido 6-acetiltiohexanoico 12 mM.

15. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque el cultivo comprende una

o dos fases de fermentación.

16. El procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado porque comprende dos fases de fermentación.

17. El procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado porque la segunda fase de fermentación tiene una duración de entre 5 y 30 horas.

18. El procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado porque la duración es de entre 7 y 26 horas.

19. El procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado porque la duración es de entre 8 y 25 horas.

20. Los PHA obtenidos mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

21. Cepa bacteriana de la especie Pseudomonas putida con número de acceso CECT 7772.

22. Uso de los PHA según la reivindicación 20 para la producción de materiales bioplásticos, tejidos, biomateriales, sistemas de liberación de fármacos, pegamentos o pinturas.

23. Uso de los PHA según la reivindicación 20 para la obtención de ácidos (R) -3-hidroxi-aciltioalcanoicos enantiopuros.

24. Uso según la reivindicación anterior donde los ácidos (R) -3-hidroxi-aciltioalcanoicos enantiopuros se seleccionan de la lista que comprende: ácido 3-hidroxi-6-acetiltiohexanoico, ácido 3-hidroxi-4-acetiltiobutanoico y los derivados hidroxilados de los ácidos 5-acetiltiopentanoico, 2, 5-bis (acetilsulfanil) pentanoico, 4-acetiltiolbutanoico, 3acetilsulfanilbutanoico, 11-acetiltioundecanoico, 16-acetilhiolhexadecanoico, 5-acetiltiooctanoico, 5

propanoyiltiooctanoico, 5-butanoiltiooctanoico, 12-acetiltiododecanoico, 6-acetilsulfanil-8-metilsulfaniloctanoico, 8acetilsulfanil-6-sulfaniloctanoico, 5- (2-metilpropanoilsulfanil) octanoico, 6, 8-bis (acetilsulfanil) octanoico.

25. Un procedimiento para la obtención de ácidos (R) -3-hidroxi-aciltioalcanoicos enantiopuros que comprende la hidrólisis de los PHA según la reivindicación 20.

26. El procedimiento según la reivindicación anterior donde la hidrólisis es química.

27. El procedimiento según la reivindicación 25 donde la hidrólisis es enzimática.

28. El procedimiento según la reivindicación anterior donde la hidrólisis la lleva a cabo una enzima depolimerasa.

29. El procedimiento según la reivindicación anterior donde la enzima depolimerasa es PhaZ.

30. Los ácidos (R) -3-hidroxi-aciltioalcanoicos enantiopuros obtenidos mediante el procedimiento según cualquiera de las cinco reivindicaciones anteriores.

FIG. 3

5 10152025 30354045

%PHA (GC)

FIG. 6

Abundance 3 4

A

Abundance 6.00 8.00 2 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 time (min)

time (min)

FIG. 10


 

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