Serina recombinasas específicas de sitio y métodos para su uso.

Un método para obtener una recombinación específica de sitio en una célula eucariota aislada,

comprendiendo elmétodo: proporcionar una célula eucariota aislada que comprende un primer sitio de recombinación y un segundositio de recombinación con una secuencia de polinucleótidos flanqueada por un tercer sitio de recombinación y uncuarto sitio de recombinación; poner en contacto los sitios de recombinación con un polipéptido de recombinasaprocariota, que tiene como resultado la recombinación entre los sitios de recombinación, en el que el polipéptido derecombinasa puede participar en la recombinación entre el primero y el tercer sitios de recombinación y el segundo yel cuarto sitios de recombinación, el primero y el segundo sitios de recombinación son attP o attB, el tercero y elcuarto sitios de recombinación son attB o attP y la recombinasa es una recombinasa del fago de Mycobacteriumtuberculosis y una recombinasa del fago de Mycobacterium smegmatis, en el que la recombinasa se selecciona delgrupo que consiste en una recombinasa fRv1 y una recombinasa Bxb1, siempre que cuando el primero y el segundositios de unión para recombinación son attB, el tercero y el cuarto sitios de unión para recombinación son attP ycuando el primero y el segundo sitios de unión para recombinación son attP el tercero y el cuarto sitios de unión pararecombinación son attB

Serina recombinasas específicas de sitio y métodos para su uso

Declaración sobre investigación con patrocinio federal

Esta invención se realizó con ayuda del gobierno con la subvención nº 70NANB1H3062, otorgada por el National Institute of Standards and Technology, Advance Technology Program. El Gobierno puede tener ciertos derechos sobre la invención.

Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la ingeniería genética. Específicamente, la invención se refiere a composiciones y métodos para integrar, delecionar, invertir, intercambiar y translocar de un modo específico de sitio un polinucleótido en el genoma de una célula. La invención se refiere también a enzima, polinucleótidos, polipéptidos y construcciones de vectores.

Antecedentes de la invención Muchos bacteriófagos y plásmidos integradores codifican sistemas de recombinación específicos de sitio que permiten la incorporación estable de su genoma en los de sus huéspedes y la escisión del genoma a partir del genoma del huésped. En estos sistemas, los requisitos mínimos para la reacción de recombinación son una enzima recombinasa que cataliza el evento de recombinación y dos sitios de recombinación (Sadowski (1986) J. Bacteriol.

165: 341-347; Sadowski (1993) FASEB J. 7: 760-767) . Para los sistemas de integración en fagos, estos se denominan sitios de unión (att) , con un elemento attP del ADN del fago y el elemento attB presente en el genoma bacteriano. Los dos sitios de unión pueden compartir una identidad de secuencia de tan solo unos pocos pares de bases. La proteína recombinasa se une a ambos sitios att y cataliza un intercambio conservador y recíproco de hebras de ADN que tiene como resultado la integración del fago circular o ADN plasmídico en el ADN del huésped. Para una reacción eficiente pueden ser necesarios fagos o factores del huésped adicionales, como la proteína de unión al ADN IHF, factor de integración del huésped (Friedman (1988) Cell 55: 545-554; Finkel y Johnson (1992) Mol. Microbiol. 6: 3257-3265) . Las integrasas de los fagos, asociadas con otros factores del huésped y/o el fago, también escinden el genoma del fago a partir del genoma bacteriano durante la fase lítica del ciclo de crecimiento de los bacteriófagos. Con el fin de aclarar la relevancia y la función de determinados genes de interés se han desarrollado diversos métodos que permiten la manipulación de genomas de mamíferos. Entre ellos, el desarrollo de cepas de ratones transgénicos y de tecnologías dirigidas a genes ha resultado ser particularmente útil (Brandon, E. P., Idzerda, R. L. y McKnight, G. S. (1995) Curr Biol, 5, 625-34; Brandon, E. P., Idzerda, R. L. y McKnight, G. S. (1995) Curr Biol, 5, 758-65) . Estas técnicas han experimentado un nuevo avance con la caracterización y aplicación de las recombinasas específicas de sitio (Kilby, N. J., Snaith, M. R. y Murray, J. A. (1993) Trends Genet, 9, 413-21) .

Las recombinasas específicas de sitio se pueden separar en dos familias principales. La primera (la familia Int o familia de las tirosina recombinasas) comprende las enzimas que catalizan la recombinación entre sitios localizados en la misma molécula de ADN (recombinación intramolecular que conlleva resolución, escisión o inversión) o en moléculas de ADN distintas (recombinación intermolecular que da lugar a la integración) (Sauer, B. (1993) Methods Enzymol, 225, 890-900; Dymecki, S. M. (1996) Proc Natl Acad Sci EE.UU., 93, 6191-6; Abremski, K. yHoess, R. 45 (1984) J Biol Chem, 259, 1509-14; Nash, H. A. (1996) en Escherichia coli and Salmonella cellular and molecular biology, ed. F. C. Neidhart, R. I. Curtis, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Rezaikoff, M. Riley, M. Schaechter y H. E. Umbager (A. S. M. Press, Washington D.C.) , pág. 2363-7) . La última propiedad se ha explotado para permitir la inserción dirigida de secuencias específicas en localizaciones precisas (Sauer, B. y Henderson, N. (1990) The New Biologist, 2, 441-9; Fukushige, S. y Sauer, B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 89, 7905-9) . Las recombinasas que se han usado para manipular genomas de mamíferos han sido, principalmente las proteínas Cre y Flp, que pertenecen a la familia Int (Kilby, N. J., Snaith, M. R. y Murray, J. A. (1993) Trends Genet, 9, 413-21) . Las secuencias diana de estas enzimas, denominados sitios loxP para la enzima Cre y FRT para la enzima Flp, consisten en una repetición invertida corta a la que se une la proteína. El proceso de recombinación es operativo a través de distancias largas (hasta 70 kb) en el genoma. Usando estas enzimas, diversos autores han 55 comunicado recombinación de ADN específica de sitio y de tejido en modelos murinos (DiSanto, J. P., Muller, W., Guy, G. D., Fischer, A. y Rajewsky, K. (1995) Proc Natl Acad Sci EE.UU., 92, 377-81; Gu, H., Marth, J. D., Orban, P. C., Mossmann, H. y Rajewsky, K. (1994) Science, 265, 103-6; Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M. y Rajewsky, K. (1995) Science, 269, 1427-9; Orban, P. C., Chui, D. y Marth, J. D. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 89, 6861-5) , translocaciones cromosómicas en plantas y en animales (Deursen, J. v., Fornerod, M., Rees, B. v. y Grosveld, G. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 92, 7376-80; Medberr y , S. L., Dale, E., Qin, M. y Ow, D. W. (1995) Nucleic Acids Res, 23, 485-90; Osborne, B. I., Wirtz, U. y Baker, B. (1995) Plant J, 7, 687-701) e inducción dirigida de genes específicos (Pichel, J. G., Lakso, M. y Westphal, H. (1993) Oncogene, 8, 3333-42) . El sistema Cre-loxP también se ha usado en combinación con promotores inducibles, tales como el promotor inducible del interferón gamma, que se usó para provocar ablación génica en el hígado con una eficiencia elevada y en menor medida en otros tejidos 65 (Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M. y Rajewsky, K. (1995) Science, 269, 1427-9) . No obstante, este sistema de recombinación específica de sitio solamente permite la inducción de un número reducido de eventos de recombinación en el mismo genoma. Dado que cada reacción de recombinación deja una secuencia diana para la recombinasa en el genoma en el sitio de cruzamiento y como las recombinasas (por ejemplo, Cre y Flp) pueden catalizar la recombinación intermolecular, la totalidad del proceso puede conducir a reorganizaciones cromosómicas indeseadas.

La segunda familia de recombinasas se denominan en conjunto la familia de resolvasas/invertasas o familia de serina (Grindley, N. D. F. (1994) en Nucleic Acids and Molecular Biology, ed. F. Eckstein y D. M. J. Lilley (Springer-Verlag, Berlín) , pág. 236-67, (Smith, M. C. y Thorpe, H.M. (2000) Mol. Microbiol., 44, 299-307) ) . Estas recombinasas específicas de sitio, que incluyen enzimas que catalizan reacciones intramoleculares e intermoleculares, podrían tener una ventaja sobre la familia Int de recombinasas. Las serina recombinasas que catalizan la integración en fagos (integrasas) están especialmente bien adaptadas para uso como herramientas de ingeniería genética. Hasta ahora se han estudiado tres serina recombinasas en células de mamífero φC31, R4 y TP901-1, (Groth, A.C. y Calos,

M.P. (2004) J. Mol. Biol. 335, 667-678) . Se ha observado que estas recombinasas son autónomas, tienen secuencias att simples y tienen la capacidad de funcionar en células de mamífero. Como se ha observado ninguna o poca recombinación entre cualquier combinación de sitios distintos a attP o attB, las integraciones son unidireccionales y existe una frecuencia de integración elevada. Las serina recombinasas proporcionan una ventaja significativa sobre los sistemas de recombinación anteriores que emplean el uso de miembros de la familia Int de recombinasas. Estas enzimas tienen numerosas aplicaciones. Una forma es la introducción de sitios att en el genoma de un organismo y el uso como dianas para la recombinación.

El solicitante ha identificado nuevas serina recombinasas que demuestran actividad sólida en diversas células de mamífero y en células vegetales, así como la capacidad de integrar de forma estable un polinucleótido en el genoma de una célula huésped o de escindir un polinucleótido del genoma de una célula huésped.

Sumario de la invención La presente invención proporciona composiciones y métodos para obtener una recombinación específica de sitio estable en una célula eucariota. Al contrario que en los métodos descritos anteriormente para la recombinación específica de sitio, las presentes recombinasas y métodos para su uso proporcionan una recombinación específica de sitio irreversible y estable.

La capacidad de las recombinasas de los fagos para una recombinación directa específica y eficiente entre secuencias de ADN en las células vivas las convierte en potencialmente útiles en diversas... [Seguir leyendo]

1. Un método para obtener una recombinación específica de sitio en una célula eucariota aislada, comprendiendo el método: proporcionar una célula eucariota aislada que comprende un primer sitio de recombinación y un segundo sitio de recombinación con una secuencia de polinucleótidos flanqueada por un tercer sitio de recombinación y un cuarto sitio de recombinación; poner en contacto los sitios de recombinación con un polipéptido de recombinasa procariota, que tiene como resultado la recombinación entre los sitios de recombinación, en el que el polipéptido de recombinasa puede participar en la recombinación entre el primero y el tercer sitios de recombinación y el segundo y el cuarto sitios de recombinación, el primero y el segundo sitios de recombinación son attP o attB, el tercero y el cuarto sitios de recombinación son attB o attP y la recombinasa es una recombinasa del fago de Mycobacterium tuberculosis y una recombinasa del fago de Mycobacterium smegmatis, en el que la recombinasa se selecciona del grupo que consiste en una recombinasa φRv1 y una recombinasa Bxb1, siempre que cuando el primero y el segundo sitios de unión para recombinación son attB, el tercero y el cuarto sitios de unión para recombinación son attP y cuando el primero y el segundo sitios de unión para recombinación son attP el tercero y el cuarto sitios de unión para recombinación son attB.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el polipéptido de recombinasa se introduce en la célula eucariota mediante la expresión de un polinucleótido que codifica el polipéptido de recombinasa.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el polipéptido de recombinasa se introduce en la célula eucariota como un polipéptido.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el polipéptido de recombinasa se introduce en la célula eucariota mediante ARN mensajero que codifica el polipéptido de recombinasa.

5. Un método para obtener recombinaciones específicas de múltiples sitios en una célula eucariota aislada, comprendiendo el método: proporcionar una célula eucariota aislada que comprende un primer sitio de recombinación y un segundo sitio de recombinación con una secuencia de polinucleótidos flanqueada por un tercer sitio de recombinación y un cuarto sitio de recombinación; poner en contacto el primero y el segundo sitios de recombinación con un primer polipéptido de recombinasa procariota, poner en contacto el tercero y el cuarto sitios de recombinación con un segundo polipéptido de recombinasa procariota, que tiene como resultado la recombinación entre el primero y el segundo sitios de recombinación y la recombinación entre el tercero y el cuarto sitios de recombinación, en el que el primer polipéptido de recombinasa puede participar en la recombinación entre el primero y el segundo sitio de recombinación y el segundo polipéptido de recombinasa puede participar en la recombinación entre el tercero y el cuarto sitios de recombinación, la primera y la segunda recombinasa son una recombinasa de fago de Mycobacterium tuberculosis o una recombinasa de fago de Mycobacterium smegmatis, en el que la recombinasa se selecciona del grupo que consiste en recombinasa φRv1 y recombinasa Bxb1, siempre que el primer polipéptido de recombinasa y el segundo polipéptido de recombinasa sean diferentes.

6. El método de la reivindicación 5, que además comprende un quinto sitio de recombinación y un sexto sitio de recombinación y un tercer polipéptido de recombinasa, en el que el tercer polipéptido de recombinasa puede participar en la recombinación entre el quinto y el sexto sitios de recombinación, siempre que el tercer polipéptido de recombinasa sea diferente al primero y al segundo polipéptidos de recombinasa.

7. Un vector para la integración específica de sitio de una secuencia de polinucleótidos en el genoma de una célula eucariota aislada, comprendiendo dicho vector un polinucleótido de interés y un segundo sitio de recombinación attB

o attP, en el que dicho segundo sitio de recombinación attB o attP comprende una secuencia de polinucleótidos que se recombina con un primer sitio de recombinación attP o attB o seudositio attP o seudositio attB en el genoma de dicha célula eucariota aislada, en el que dicho vector comprende además un polinucleótido que codifica una recombinasa del fago de Mycobacterium tuberculosis o una recombinasa del fago de Mycobacterium smegmatis, en el que la recombinasa se selecciona del grupo que consiste en una recombinasa φRv1 y una recombinasa Bxb1, con la condición de que cuando el primer sitio de recombinación es attB o seudo attB, el segundo sitio de recombinación es attP y cuando el primer sitio de recombinación es attP o seudo attP, el segundo sitio de recombinación es attB.

8. El vector de la reivindicación 7, en el que el polinucleótido de interés está unido operativamente a un promotor que participa en la expresión del polinucleótido en la célula eucariota.

9. Una secuencia de polinucleótidos aislada que comprende un ácido nucleico que tiene una identidad de al menos un 90 % con la secuencia de ácido nucleico SEC ID Nº: 5 o SEC ID Nº 9, en la que el polipéptido codificado por el ácido nucleico tiene actividad recombinasa.

10. La secuencia de polinucleótidos aislada de la reivindicación 9, en el que la secuencia de ácido nucleico es la SEC ID Nº 5 o la SEC ID Nº 9.