Secuencias de la gripe.

Una combinación de ácidos nucleicos que comprende cebadores de SEQ ID NO:

1 a SEQID NO: 16 como se muestra en la Tabla D1, o una variante, homólogo, derivado o fragmentode al menos 20 nucleótidos de longitud de las mismas que tiene al menos un 90% de identidadde secuencia con las mismas, para la amplificación de ácido nucleico de una secuencia devirus de la gripe, y sondas de SEQ ID NO: 17 a SEQ ID NO: 53 como se muestra en la TablaD2, o una variante, homólogo, derivado o fragmento de al menos 20 nucleótidos de longitud delas mismas que tenga al menos un 90% de identidad de secuencia con las mismas, donde lassondas se inmovilizan y son capaces de hibridar con una secuencia de virus de la gripe.

CAMPO [0001] La presente invención está relacionada con los campos de la medicina, biología celular, biología molecular y genética. Más específicamente, la invención hace referencia a métodos y secuencias de ácido nucleico adecuados para su uso en la detección de un patógeno o productos del mismo en una muestra.

ANTECEDENTES [0002] La influenza o gripe es una enfermedad infecciosa frecuentemente subestimada que puede resultar en altos índices de morbilidad y mortalidad especialmente en personas mayores y pacientes de alto riesgo. Los virus de la gripe A y gripe B son los responsables del virus de la gripe original que es contraído por varios cientos de millones de personas al año en todo el mundo. Los virus de la gripe A y gripe B infectan principalmente las cavidades nasofaríngeas y orofaríngeas e inicialmente causan síntomas respiratorios generales en las personas afectadas. No es posible ni siquiera por parte de profesionales médicos con experiencia diagnosticar la gripe de forma fiable exclusivamente sobre la base de los síntomas clínicos del paciente ya que otros virus que infectan la cavidad nasal o faríngea como adenovirus, virus de la parainfluenza o virus sincitial respiratorio (virus RS, en inglés) causan síntomas similares. [0003] La gripe A es una enfermedad infecciosa de animales causada por las cepas de tipo A del virus de la gripe que normalmente afecta a aves y, de forma menos común, a cerdos. Existen numerosos subtipos del virus de la gripe A. Estos subtipos se basan en el segmento de hemaglutinina (HA) , que tiene 16 variedades (H1-H16) y segmento de neuraminidasa (NA) , que tiene 9 variedades (N1-N9) . La razón para el alto grado de variabilidad genética y, por ello, inmunológica, especialmente de los virus de la gripe A se debe a que puede ocurrir también un cambio genético (redistribución de los genes virales) en casos poco comunes además de la deriva genética habitual (mutación puntual) . Esto se debe a que, a diferencia de otros virus, el genoma de los virus de la gripe es segmentado y que la gripe A es un patógeno tanto en seres humanos como en animales. La gripe B infecta solo a seres humanos. [0004] Debido a la alta importancia médica de las infecciones por gripe, casi todos los países del mundo cuentan ahora con una sistema de nacional de vigilancia de la gripe. Para este programa, los médicos de cabecera recogen hisopados de la nariz y/o garganta y los envían al centro nacional de referencia respectivo. Después, los virus de la gripe A/B se detectan normalmente mediante eluido de los hisopados y posterior cultivo de las muestras de pacientes en células de mamífero como células MDCK (células de riñón canino Madine-Darby) . El cultivo en estos laboratorios especiales puede llevar hasta 14 días y, por ello, no tiene una relevancia inmediata para el diagnóstico de los pacientes individuales. En su lugar, el objetivo de los centros de referencia nacionales es determinar el tipo y subtipo de los virus cultivados e informar de los resultados a la Organización Mundial de la Salud (OMS) . El trabajo del fabricante de vacunas es entonces adaptar las vacunas de la gripe del año próximo a las últimas cepas virales en circulación basándose en la recomendación anual de la OMS. [0005] Por tanto, la detección rápida y fiable de la infección por el virus de la gripe A es muy importante. Los métodos de laboratorio actuales de detección de infecciones por gripe A y B implican comúnmente la detección de antígeno, aislamiento en cultivo celular o detección de ARN específico S

de la gripe mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR, por sus siglas en inglés) . Existe un gran problema con el uso de detección de antígeno debido a la sensibilidad de dichas pruebas. Los kits de prueba rápidos generalmente proporcionan resultados en 24 horas y son aproximadamente un 70% sensibles para detectar la gripe y aproximadamente un 90% específicos. La sensibilidad de los kits de prueba rápida significa que un porcentaje tan alto como el 30% de las muestras pueden dar falsos negativos y las pruebas no son multiplexadas. Cada una de estas técnicas de ensayo presenta ventajas y desventajas que las hacen más o menos adecuadas para su uso en laboratorios de sanidad pública o laboratorios en hospitales, pero ninguno de estos ensayos existentes se emplean actualmente en puntos de atención a pacientes: Todos se llevan a cabo en un laboratorio y normalmente los resultados no se producen lo suficientemente rápido para tener un impacto en el tratamiento prescrito. El aislamiento del virus en cultivo celular resulta laborioso y requiere tiempo. [0006] Actualmente, como ha estipulado la Organización Mundial de la Salud, los métodos de diagnóstico recomendados para la identificación del virus de la gripe aviar A en seres humanos son el ensayo de inmunofluorescencia (IFA, en inglés) , cultivo de virus y ensayos PCR. Los métodos de IFA y cultivo de virus son laboriosos y no son viables para grandes cantidades de muestras. [0007] WO 00/17391 describe un método de RT-PCR multiplex y cebadores para determinar la presencia de microorganismos que infecten las vías respiratorias. WO 2008/042450 describe la detección multiplex de patógenos respiratorios en una muestra. US 2007/0224594 describe métodos para detectar el virus de la gripe. Wu et al. (Journal of Virological Methods, 148 (2008) 81-88) describe un método de RT-PCR novedoso para detectar subtipos de gripe A. WO 2008/054830 describe una matriz que tiene sondas de captura para detectar y diagnosticar la presencia de virus de la gripe. [0008] La amenaza de una pandemia de gripe ha impulsado la necesidad de un nuevo sistema de prueba para el diagnóstico de la gripe que debería ser capaz de realizar una detección rápida y fiable de la gripe humana, con la capacidad de identificar y diferenciar gripe estacional A y B de nueva gripe A, así como de detectar nuevas cepas emergentes de gripe A.

La detección y determinación de tipo rápida, sensible y específica del virus de la gripe y la identificación de sus diversas cepas es vital para la identificación y control de una potencial pandemia humana. También se percibe una necesidad de un ensayo de la gripe informativo que pueda llevarse a cabo en el campo, es decir, en el punto de atención (quot;POCquot;, en inglés) .

RESUMEN

Según un primer aspecto de la presente invención, proporcionamos una combinación de ácidos nucleicos que comprenden cebadores de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 16 como se muestra en la Tabla D1, o una variante, homólogo, derivado o fragmento de al menos 20 nucleótidos de longitud de las mismas que tenga al menos un 90% de identidad de secuencia con las mismas, para la amplificación de ácido nucleico de una secuencia del virus de la gripe, y sondas de SEQ ID NO: 17 a SEQ ID NO: 53 como se muestra en la Tabla D2, o una variante, homólogo, derivado o fragmento de al menos 20 nucleótidos de longitud de las mismas que tenga al menos un 90% de identidad de secuencia con las mismas, donde las sondas se inmovilizan y son capaces de hibridar con una secuencia de virus de la gripe.

La combinación puede comprender además una o más de las secuencias de cebadores S

expuestas en la Tabla D3.

La combinación puede comprender además una o más de las secuencias de sonda expuestas en la Tabla D4.

Las sondas pueden inmovilizarse en forma de una matriz, como una micromatriz.

La combinación puede usarse en un dispositivo que comprende una primera cámara para la amplificación de ácido nucleico de la secuencia de virus de la gripe usando cebadores y una segunda cámara para la hibridación de ácido nucleico de la secuencia de virus de la gripe usando las sondas inmovilizadas. La primera y segunda cámara del dispositivo pueden encontrarse en conexión de fluido. [0015] Según un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para la detección de una secuencia de virus de la gripe en una muestra biológica y/o la determinación de la cepa de una secuencia de virus de la gripe en una muestra biológica, que comprende:

a) llevar a cabo una amplificación de ácido nucleico que comprende amplificar la secuencia de virus de la gripe para producir amplicones usando cebadores de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 16 como se muestra en la Tabla D1, o una variante, homólogo, derivado o fragmento de al menos 20 nucleótidos de longitud de las mismas que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con las mismas. b) llevar a cabo una hibridación de ácido nucleico que comprende hibridar la secuencia de virus de la gripe amplificada a las sondas inmovilizadas de la SEQ ID NO: 17 a SEQ ID NO: 53 como se muestra en la Tabla D2, o una variante, homólogo, derivado o fragmento de al menos 20 nucleótidos... [Seguir leyendo]

Varias modificaciones y variaciones de los métodos y sistemas descritos de la invención pueden ser evidentes para aquellos con experiencia en la técnica sin salir del alcance de la invención según la definición en las reivindicaciones adjuntas. Aunque se ha descrito la invención en relación con los modos de realización preferidos específicos, debería entenderse que la invención tal y como se reivindica no debe limitarse de forma indebida a dichos modos de realización específicos.

1. Una combinación de ácidos nucleicos que comprende cebadores de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 16 como se muestra en la Tabla D1, o una variante, homólogo, derivado o fragmento de al menos 20 nucleótidos de longitud de las mismas que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con las mismas, para la amplificación de ácido nucleico de una secuencia de virus de la gripe, y sondas de SEQ ID NO: 17 a SEQ ID NO: 53 como se muestra en la Tabla D2, o una variante, homólogo, derivado o fragmento de al menos 20 nucleótidos de longitud de las mismas que tenga al menos un 90% de identidad de secuencia con las mismas, donde las sondas se inmovilizan y son capaces de hibridar con una secuencia de virus de la gripe.

2. La combinación de la reivindicación 1, en la que las sondas se inmovilizan en la forma de una matriz.

3. La combinación de la reivindicación 2, en la que la matriz es una micromatriz.

4. Una combinación según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la combinación comprende también una o más de las secuencias de cebadores presentadas en la Tabla D3.

5. Una combinación según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la combinación comprende también una o más de las secuencias de sonda presentadas en la Tabla D4.

6. La combinación de cualquiera de las reivindicaciones previas para su uso en un dispositivo que comprende una primera cámara para la amplificación de ácido nucleico de la secuencia de virus de la gripe usando los cebadores y una segunda cámara para la hibridación de ácido nucleico de la secuencia de virus de la gripe usando las sondas inmovilizadas.

7. La combinación de la reivindicación 6, en la que la primera y segunda cámara del dispositivo se encuentran en conexión de fluido.

8. Un método para detectar una secuencia de virus de la gripe en una muestra biológica y/o determinar la cepa de una secuencia de virus de la gripe en una muestra biológica, que comprende:

a) llevar a cabo una amplificación de ácido nucleico que comprende amplificar la secuencia de virus de la gripe para producir amplicones usando cebadores de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 16 como se muestra en la Tabla D1, o una variante, homólogo, derivado o fragmento de al menos 20 nucleótidos de longitud de las mismas que tenga al menos un 90% de identidad de secuencia con las mismas;

S b) llevar a cabo una hibridación de ácido nucleico que comprende hibridar la secuencia de virus de la gripe amplificada a sondas inmovilizadas de SEQ ID NO: 17 a SEQ ID NO: 53 como se muestra en la Tabla D2, o una variante, homólogo, derivado o fragmento de al menos 20 nucleótidos de longitud de las mismas que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con las mismas; y c) detectar el enlace entre la sonda inmovilizada y la secuencia de virus de la gripe amplificada.

9. El método de la reivindicación 8, en el que el paso de amplificación de ácido nucleico a) se lleva a cabo en una primera cámara de un dispositivo, y el paso de hibridación de ácido nucleico b) se lleva a cabo en una segunda cámara del dispositivo.

10. El método de la reivindicación 8 o 9, en el que el método es capaz de realizar una detección multiplex de dianas.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones de la 8 a la 10, en la que el paso de amplificación de ácido nucleico a) comprende además amplificar la secuencia de gripe usando una o más de las secuencias de cebadores presentadas en la Tabla D3.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones de la 8 a la 11, en el que el paso de hibridación de ácido nucleico b) comprende además hibridar la secuencia de gripe usando una

o más de las secuencias de sonda presentadas en la Tabla D4.

S