RT-PCR rápida en una etapa.

Método para llevar a cabo una RT-PCR en una etapa para la amplificación de un ARN diana,

que comprende las etapas de:

a) obtener una muestra que supuestamente contiene dicho ARN diana,

b) añadir una mezcla de reacción que comprende todos los reactivos necesarios para transcribir inversamente dicho ARN diana en ADNc y amplificar por lo menos una parte de dicho ADNc,

c) incubar dicha muestra durante un intervalo de tiempo de entre 0 y 40 segundos a una temperatura de entre 20ºC y 65ºC,

d) someter dicha muestra a múltiples ciclos de un protocolo de termociclado, en el que la temperatura de dicha muestra se varía entre por lo menos una primera temperatura de entre 90ºC y 100ºC y una segunda temperatura de entre 50ºC y 75ºC.

RT-PCR rápida en una etapa Antecedentes de la invención La presente invención se refiere al campo del análisis de la expresión de ARNm mediante la realización de una reacción de transcriptasa inversa y posteriormente una reacción en cadena de la polimerasa, con el fin de cuantificar la cantidad de ADNc generada. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método mejorado para llevar a cabo una RT-PCR en una etapa, caracterizado porque el tiempo para la reacción de la transcriptasa inversa se ha minimizado.

Técnica anterior

El descubrimiento de las transcriptasas inversas en los años setenta refutó el "dogma central" de la biología molecular de la transferencia de información desde el ADN pasando por el ARN hasta las proteínas como un proceso unidireccional (Temin H. y Mizutani S., Nature 226:1211-1213, 1970; Baltimore D., Nature 226:1209-1211, 1970) . La caracterización enzimática de estas ADN polimerasas dependientes de ARN es la base para la comprensión actual del ciclo de amplificación de los virus ARN y, de esta manera, también para el desarrollo y propagación de enfermedades causadas por este tipo de virus (cáncer, SIDA, etc.) .

Sin embargo, las transcriptasas inversas también son una herramienta a disposición del biólogo molecular para la síntesis, amplificación y clonación del ADNc (RT-PCR) . Esta tecnología permite un examen simplificado y acelerado de la expresión génica en las células eucarióticas. Tras aislar el ARNm total de extractos celulares o tejidos, el ARNm es traducido nuevamente en ADNc por la transcriptasa inversa y amplificado en una etapa posterior de PCR, permitiendo la clonación y la caracterización. En consecuencia no resulta necesario, por una parte, elucidar las estructuras de intrón y exón de los genes, aunque, por otra parte, además resulta posible examinar la expresión génica en la célula durante diversos ciclos vitales o durante el desarrollo de enfermedades (tales como el cáncer) .

Hasta el momento se han examinado detenidamente las transcriptasas inversas (RT) de tres retrovirus diferentes: la RT del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV) . Este enzima consiste de una única subunidad con un peso molecular de 78 kDa (Prasad V.R., 1993, revisado en Reverse Transcriptase, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laborator y Press, 135) . Además es conocida una RT del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) . Esta RT es un heterodímero compuesto de dos subunidades, p66 y p51; la subunidad p51 se forma por corte proteolítico de p66 (Le Grice S.F.J., 1993, revisado en Reverse Transcriptase, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laborator y Press, 163) . Además, se conocen las RT del virus del sarcoma-leucosis aviar (VSLA) . La RT obtenible del virus de la mieloblastosis aviar (VMA) también pertenece a la familia del VSLA. Esta RT también es un heterodímero compuesto de una cadena α de un peso molecular de aproximadamente 63 kDa y una cadena β de un peso molecular de aproximadamente 95 kDa. En este caso, la cadena α también se forma mediante procesamiento proteolítico de la cadena β (Golomb M. y Grandgenett D.J., Biol. Chem. 254:1606-1613, 1979; Weiss R. et al., Molecular Biology of tumor viruses, 2a edición: RNA tumor viruses 1/texto. Cold Spring Harbor Laborator y , Cold Spring Harbor, New York (editores, 1984) ) .

También existen ADN polimerasas termoestables que, además de su actividad de ADN polimerasa dependiente de ADN, se ha dado a conocer que comprenden una actividad de transcriptasa inversa dependiente de ARN. Estos enzimas resultan particularmente útiles para métodos de realización de una PCR en una etapa, caracterizados porque, después de una etapa de transcripción inversa, el ADNc generado se amplifica mediante PCR sin apertura intermedia del recipiente de reacción.

Una de las ADN polimerasas conocidas que presenta una actividad elevada de transcriptasa inversa es la obtenible de Thermus thermophilus (polimerasa Tth) (patente WO nº 91/09944 y patente US nº 5.561.058) . La polimerasa Tth, así como la polimerasa Taq, no presentan actividad correctora exonucleolítica 3' a 5'. Esta actividad de exonucleasa 3' a 5' se considera generalmente que resulta deseable porque permite la eliminación de las bases mal incorporadas o desapareadas en las secuencias de ácidos nucleicos recién sintetizadas. Otra ADN polimerasa termofílica de tipo pol I aislada a partir de Thermotoga maritima (pol Tma) presenta actividad de exonucleasa 3' a 5'. La patente US nº

5.624.833 proporciona medios para aislar y producir polimerasa Tma. Sin embargo, ambas ADN polimerasas, la polimerasa Tth y la Tma, muestran actividad de transcriptasa inversa únicamente en la presencia de iones manganeso.

La ADN polimerasa de Carboxydothermus hidrogenoformans muestra actividad de transcripción inversa en presencia de iones magnesio y en ausencia sustancial de iones manganeso, y puede utilizarse para transcribir inversamente el ARN, con el fin de detectar y amplificar (en combinación con una ADN polimerasa termoestable como Taq) , secuencias específicas de ARN. Mediante la utilización de la ADN polimerasa de Carboxydothermus hydrogenoformans, se observa una elevada especificidad de transcripción con tiempos de incubación cortos. Se observa una especificidad elevada aplicando, por ejemplo, 5 minutos de incubación y 33 unidades de proteína ADN polimerasa. Con tiempos de incubación más largos, así como con cantidades más bajas de polimerasa de Carboxydothermus hydrogenoformans, pueden obtenerse productos específicos. Sin embargo, se produce un abanico inespecífico de productos. Estos productos inespecíficos pueden estar causados por la actividad de exonucleasa 5' a 3' de la polimerasa, lo que permite que el enzima corte el molde en estructuras secundarias (actividad "ARNasaH") y genere cebadores adicionales que pueden ser alargados por la actividad de ADN polimerasa.

También se ha establecido en la técnica cómo proporcionar mezclas de enzimas transcriptasa inversa y ADN polimerasa termoestables con el fin de proporcionar una mezcla de reactivos que pueda utilizarse para llevar a cabo una amplificación por RT-PCR en 1 etapa (patente WO nº 94/08032) . Estas mezclas ahora se encuentran disponibles comercialmente de una diversidad de proveedores y, de esta manera, son los utilizados más frecuentemente en la técnica (Qiagen nº de cat. 210210, 210212) , (USB nº de cat. 78350) , (Clontech nº de cat. K1403-1) , (Invitrogen nº de cat. 11736-051 y 11736-059) .

Sin embargo, todos los protocolos publicados y recomendados hasta el momento requieren un intervalo de tiempo sustancial para llevar a cabo la etapa de reacción de la transcriptasa inversa previamente al protocolo de termociclado por PCR. El intervalo de tiempo recomendado habitualmente es de entre 30 minutos y 1 hora (Qiagen, Clontech, USB) . Se dan a conocer etapas de reacción de transcriptasa inversa de 5 minutos para la RT-PCR en 1 etapa utilizando la ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Myers T.W. y Gelfand D.H., Biochemistr y 30:76617666, 1991) . Se recomienda una etapa de reacción de la transcriptasa inversa de 3 minutos para la mezcla de enzimas Superscript/Platinum de Invitrogen (nº de cat. 11736-051 y 11736-059) . Además, la patente US nº

5.561.058 da a conocer un intervalo de tiempo mínimo de 1 minuto como el tiempo mínimo requerido para llevar a cabo la reacción de la transcriptasa inversa previamente al termociclado por PCR.

De esta manera, todos los métodos dados a conocer anteriormente requieren una etapa de preincubación de larga duración a temperaturas más bajas, de manera que la etapa de reacción de transcriptasa inversa pueda tener lugar. Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar un método mejorado de RT-PCR en una etapa.

Breve descripción de la invención En vista de la técnica anterior citada anteriormente, resultó muy inesperado que la etapa de la transcriptasa inversa pudiese acortarse a intervalos de tiempo muy cortos o incluso omitirse por completo la preincubación. De esta manera, la presente invención se refiere a un método para llevar a cabo una RT-PCR en una etapa destinada a la amplificación de un ARN diana, comprendiendo las etapas siguientes:

a) obtener una muestra que supuestamente contiene dicho ARN diana,

b) añadir una mezcla de reacción que comprende todos los reactivos necesarios para transcribir inversamente dicho ARN diana en ADNc y amplificar por lo menos una parte de dicho ADNc,

c) incubar dicha muestra durante un intervalo de tiempo de entre 0 y 40 segundos a una temperatura de entre 20ºC y 65ºC,

d) someter dicha muestra a múltiples ciclos de un protocolo de termociclado, en... [Seguir leyendo]

1. Método para llevar a cabo una RT-PCR en una etapa para la amplificación de un ARN diana, que comprende las etapas de:

a) obtener una muestra que supuestamente contiene dicho ARN diana, b) añadir una mezcla de reacción que comprende todos los reactivos necesarios para transcribir inversamente dicho ARN diana en ADNc y amplificar por lo menos una parte de dicho ADNc, c) incubar dicha muestra durante un intervalo de tiempo de entre 0 y 40 segundos a una temperatura de entre 20ºC y 65ºC, d) someter dicha muestra a múltiples ciclos de un protocolo de termociclado, en el que la temperatura de dicha muestra se varía entre por lo menos una primera temperatura de entre 90ºC y 100ºC y una segunda temperatura de entre 50ºC y 75ºC.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho intervalo de tiempo de la etapa c) es de menos de 20 segundos.

3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque dicho intervalo de tiempo es de 0 segundos.

4. Método según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la temperatura en la etapa c) es de entre 37ºC y 55ºC.

5. Método según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicha reacción de RT-PCR en una etapa es catalizada por una polimerasa termoestable que comprende actividad de polimerasa dependiente de ADN y actividad de transcriptasa inversa.

6. Método según la reivindicación 5, caracterizado porque dicha polimerasa puede obtenerse de Thermus thermophilus.

7. Método según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicha reacción de RT-PCR en una etapa es catalizada por una mezcla de por lo menos una polimerasa termoestable que comprende actividad de polimerasa dependiente de ADN y por lo menos una transcriptasa inversa.

8. Método según las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque dicha porción de dicho ADNc es menor de 0, 2 kb.

9. Método según las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se realiza un seguimiento en tiempo real del progreso de dicha reacción de RT-PCR en una etapa.