Recipiente para el análisis de ácidos nucleicos.

Recipiente para la recogida de muestras, preferiblemente recolección de sangre,

que contiene una solución acuosa que contiene una sal de guanidinio, una sustancia tamponante, un agente reductor y un detergente, que es capaz de estabilizar los ácidos nucleicos, y una fase sólida, capaz de fijar ácidos nucleicos, caracterizado por que tiene una presión negativa en el espacio previsto para la recolección de muestras.

Recipiente para el análisis de ácidos nucleicos La presente invención se refiere a un recipiente para la recogida de muestras, preferiblemente para la recolección de sangre, en donde la sangre extraída se debe utilizar de forma particular para la estabilización, aislamiento y análisis de ácidos nucleicos. Por el estado de la técnica se conocen procedimientos para el aislamiento de ácidos nucleicos (véanse, por ejemplo, los documentos DE 19702907, EP 0389063 o WO 97/05248) .

De manera convencional, durante la extracción la sangre se recoge en recipientes que ya contienen anticoagulantes tales como, por ejemplo, heparina, citrato o EDTA. De esta forma se evita que la sangre coagule. Las muestras de sangre obtenidas de este modo se pueden conservar, a temperaturas adecuadas, durante periodos de tiempo prolongados. Sin embargo, esta clase de obtención de sangre tiene considerables inconvenientes cuando se deben analizar ácidos nucleicos tales como, por ejemplo, ARNm o ADN. Para estos fines, los ácidos nucleicos contenidos en la muestra se deben estabilizar de forma óptima ya en el mismo momento de la recogida, es decir, se debe evitar la degradación de los ácidos nucleicos presentes y, del mismo modo, la neosíntesis de ARNm.

Hasta la fecha, no se ha alcanzado este objetivo de almacenar de forma estable los ácidos nucleicos contenidos en el material de muestra, durante el almacenamiento de la sangre desde el momento de su extracción, por las siguientes razones:

Las células contienen nucleasas, es decir, enzimas que degradan los ácidos nucleicos tan pronto como entran en contacto con sus sustratos (ARN, ADN) . La acción de las nucleasas celulares y extracelulares se halla normalmente bajo control fisiológico, con la condición de que las células se encuentren en su ambiente habitual. La extracción de sangre da lugar a modificaciones más o menos intensas de los ácidos nucleicos contenidos en todas las células. Entonces, en el interior de las células y/o a causa de la lisis celular, se produce la liberación de nucleasas hacia el medio exterior. Además, se sintetizan ácidos nucleicos con mayor o menor intensidad. Precisamente, el almacenamiento prolongado de la sangre produce el envejecimiento y la degradación de las células.

Un problema adicional del almacenamiento a largo plazo de muestras de sangre obtenidas por los procedimientos de extracción habituales es la fuerte alteración del material de muestra. Estas alteraciones tales como, por ejemplo, la intensa lisis celular, pueden dar lugar a que los procedimientos convencionales de aislamiento de ácidos nucleicos no tengan resultados satisfactorios en cuanto a la eficiencia y reproducibilidad.

Al margen de los problemas de almacenamiento estable de los ácidos nucleicos contenidos en el material de prueba, en los procedimientos actuales de recolección de sangre existen otras dificultades. A menudo, en el aislamiento de ácidos nucleicos los anticoagulantes habituales no se separan con suficiente eficiencia e interfieren en el análisis posterior de los ácidos nucleicos tales como, por ejemplo, la amplificación por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) . Por ejemplo, en general la heparina es un inhibidor conocido de la PCR.

Por último, en el análisis cuantitativo de los ácidos nucleicos se plantea la cuestión de cómo se puede controlar el procedimiento completo, desde la recogida de la muestra hasta la medición de ácidos nucleicos, bajo condiciones estandarizadas. En el mejor de los casos, ya durante la recolección de la muestra, se debería agregar un ácido nucleico estándar definido cuantitativa y cualitativamente que se vaya a someter al proceso integral de recepción de la muestra y su determinación. Tampoco esto es viable con los actuales sistemas de extracción.

Un inconveniente adicional de la recolección de sangre convencional es el riesgo de transmisión de material infeccioso, dado que hasta la fecha se requiere la realización de etapas manuales durante el procedimiento para el aislamiento del ácido nucleico. No se puede excluir el contacto con agentes patógenos potencialmente infecciosos.

En la bibliografía se describe un procedimiento en el que la muestra de sangre se mezcla con sal de guanidinio inmediatamente después de su extracción del paciente (documento EP 0818542A1) . En este procedimiento, la sal de guanidinio está en forma de polvo para aprovechar de este modo la mayor estabilidad de la sal de guanidinio. Este procedimiento tiene, sin embargo, serios inconvenientes, dado que, por ejemplo, la sal se debe disolver en primer lugar en la sangre incorporada. El proceso de disolución es particularmente dependiente de la temperatura y no se puede controlar debido a la opacidad del material de muestra utilizado. El uso de un producto de este tipo con fines diagnóstico-médicos resulta, por lo tanto, muy problemático.

Las nucleasas son enzimas extraordinariamente activas, que se pueden inhibir sólo bajo condiciones de desnaturalización extremas. La desnaturalización depende de la concentración de la sal de guanidinio en solución. En el procedimiento del documento EP 0818542 no se indica desde el comienzo una concentración inhibitoria de sal de guanidinio en solución. Por lo tanto, se produce una degradación incontrolada de ácidos nucleicos durante el proceso de disolución. Además, en este procedimiento se renuncia a la adición de agentes reductores, sin los cuales normalmente no es posible garantizar una inhibición eficaz, en especial de RNasas.

Aparte de ello, la muestra obtenida según los métodos actuales no se puede utilizar directamente para el aislamiento adicional de ácidos nucleicos en fases sólidas. El empleo del polvo de sal de guanidinio tampoco permite la adición de estándares internos de ácidos nucleicos. No obstante, estos estándares son imprescindibles para el control del procedimiento y una cuantificación exacta.

La presente invención tuvo como problema técnico poner a disposición un recipiente que no presente los inconvenientes del estado de la técnica. De forma especial, la muestra recogida con el recipiente se debe poder destinar directamente a los procedimientos analíticos habituales de ácidos nucleicos, sin necesidad de llevar a cabo etapas adicionales para la preparación de la muestra.

Este problema se resuelve según la invención por medio de un recipiente para la recolección de muestras con las características de la reivindicación 1.

En las reivindicaciones secundarias se ofrecen realizaciones preferidas adicionales.

El recipiente según la invención posee las siguientes ventajas: 1. La muestra, preferiblemente sangre, se somete a lisis en el mismo momento de la extracción, para lo que el recipiente de recolección contiene ya una solución de lisis que, al mismo tiempo, es una solución estabilizadora de ácidos nucleicos, 2. La solución estabilizadora de ácidos nucleicos actúa estabilizando el material de muestra, en particular los ácidos nucleicos que contiene, inmediatamente después del contacto con la solución, 3. La solución estabilizadora de ácidos nucleicos se selecciona, adicionalmente, de manera que el material de la muestra se pueda utilizar directamente en el siguiente procedimiento de aislamiento, 4. La solución estabilizadora de ácidos nucleicos se puede separar en el siguiente aislamiento de forma tan eficaz que no se produce una inhibición, por ejemplo, de la PCR. 5. A la solución estabilizadora de ácidos nucleicos se le puede agregar un estándar interno. Esto permite el control del procedimiento completo, desde la recolección de la muestra hasta la detección del ácido nucleico. 6. La fase sólida presente en el recipiente es especialmente apropiada para un aislamiento posterior de los ácidos nucleicos unidos a la misma. Además, por medio de la unión preferida de los ácidos nucleicos a la fase sólida se simplifica el aislamiento posterior, dado que en el recipiente tiene lugar una primera separación del ácido nucleico y otros componentes adicionales de la muestra.

La solución estabilizadora de ácidos nucleicos se puede seleccionar de manera que el ácido nucleico se una a la superficie correspondiente inmediatamente después de la lisis celular, o lo haga sólo después de la adición de otros reactivos. El primer caso tiene lugar, por ejemplo, cuando se utiliza una superficie de vidrio en presencia de una sal de guanidinio. El segundo caso se produce, por ejemplo, depositando una superficie recubierta con biotina y la adición posterior de estreptavidina con propiedades de unión a los ácidos nucleicos.

El recipiente se puede usar básicamente para la recogida de cualquier fluido corporal. De forma particular, es adecuado para la recogida de fluidos corporales... [Seguir leyendo]

1. Recipiente para la recogida de muestras, preferiblemente recolección de sangre, que contiene una solución acuosa que contiene una sal de guanidinio, una sustancia tamponante, un agente reductor y un detergente, que es capaz de estabilizar los ácidos nucleicos, y una fase sólida, capaz de fijar ácidos nucleicos, caracterizado por que tiene una presión negativa en el espacio previsto para la recolección de muestras.

2. Recipiente según la reivindicación 1, caracterizado por que la sal de guanidinio se selecciona entre tiocianato de guanidinio y cloruro de guanidinio.

3. Recipiente según las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que la sal de guanidinio está presente en una concentración de 1 hasta 8 M.

4. Recipiente según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la solución tiene, tras la adición del material de muestra, un valor de pH de 4 a 7, 5, y por que la solución tamponante se selecciona entre Tris (hidroximetil) -aminometano (Tris) , ácido 2- (4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil) -etanosulfónico (HEPES) , ácido 3- (Nmorfolino) -propanosulfónico (MOPS) , ácido 2- (N-morfolino) -etanosulfónico (MES) , tampón de citrato y fosfato.

5. Recipiente según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la fase sólida está presente, de manera separada, como material no tejido, filtro, partícula, gel, esfera, tapón y/o varilla, y/o está unida directamente con el recipiente.

6. Recipiente según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la sustancia tamponante está presente en una concentración de 10 a 300 mM.

7. Recipiente según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que el detergente se selecciona entre Triton-X-100, NP-40, Polidocanol y Tween 20.

8. Recipiente según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que el detergente está presente en una concentración de 5 a 30% en peso.

9. Recipiente según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que el agente reductor se selecciona entre ditiotreitol (DTT) , 1-mercaptoetanol y Tris (2-cloroetil) fosfato (TCEP) .

10. Recipiente según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que el agente reductor está presente en una concentración de 0, 1 a 10, 0% en peso.

11. Recipiente según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que el pH de la solución se encuentra entre 4, 0 y 7, 5.

12. Recipiente según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por que tras la adición del material de muestra se alcanza un valor de pH entre 5, 0 y 7, 5.

13. Recipiente según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por que la solución contiene los siguientes componentes: Tiocianato de guanidinio 4, 5 M; MES 50 mM; 15% (p/v) de Triton-X-100; DTT 100 mM, en donde el pH se ajusta de forma que, tras la adición de sangre, se obtiene un pH de 6, 0 a 7, 5.

14. Procedimiento para estabilizar y/o aislar ácidos nucleicos de la sangre total, que comprende las etapas de recolectar sangre total en un recipiente según una de las reivindicaciones 1 a 13 y, eventualmente, aislar los ácidos nucleicos unidos a la fase sólida.

Fig. 4

Fig. 5 Fig. 6 Fig. 7