Reactivos peptídicos específicos de prión.

Un reactivo peptídico aislado que interacciona preferentemente con PrPSc en comparación con PrPC,

en el quedicho reactivo peptídico es un péptido seleccionado del grupo que consiste en péptidos que tienen SEC ID Nº: 12,14-15, 22, 26-31, 33-37, 39-43, 45-48, 50-63, 65-69, 71-73, 77, 81-82, 84-85, 87-94, 96-101 y 103-132 o un análogoo derivado de los mismos, en el que dicho derivado tiene una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones, y queincluye opcionalmente modificaciones después de la expresión del polipéptido.

Reactivos peptídicos específicos de prión Campo de la invención La invención se refiere a reactivos peptídicos que interaccionan con proteínas priónicas, polinucleótidos que codifican estos reactivos peptídicos, procedimientos para generar anticuerpos usando tales reactivos peptídicos y polinucleótidos, y a anticuerpos generados usando estos procedimientos. La invención se refiere además a procedimientos para usar estos reactivos peptídicos para detectar la presencia de priones patógenos en una muestra y a procedimientos para usar estos reactivos peptídicos como componentes en una composición terapéutica o profiláctica.

Antecedentes Las enfermedades conformacionales proteicas incluyen una diversidad de enfermedades no relacionadas, incluyendo encefalopatías espongiformes transmisibles, que surgen de transición conformacional aberrante de una proteína (una proteína de enfermedad conformacional) que a su vez conduce a auto-asociación de las formas de proteína aberrantes, con deposición de tejido y daño posterior. Estas enfermedades también comparten similitudes sorprendentes en presentaciones clínicas, típicamente una progresión rápida de diagnóstico a enfermedad después de diversos tiempos de incubación.

Un grupo de enfermedades conformacionales se denomina “enfermedades priónicas” o “encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE) ”. En seres humanos estas enfermedades incluyen enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) , síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS) , Insomnio Familiar Letal y Kuru (véase, por ejemplo, Harrison’s Principles of Internal Medicine, Isselbacher y col., eds., McGraw-Hill, Inc. Nueva York, (1994) ; Medori y col. (1992) N. Engl. J. Med. 326: 444-9.) . En animales las TSE incluyen tembladera de ovejas, encefalopatía espongiforme bovina (BSE) , encefalopatía transmisible del visón y enfermedad de debilitamiento crónico de ciervo mulo y alce en cautividad (Gajdusek, (1990) Subacute Spongiform Encephalopathies: Transmissible Cerebral Amyloidoses Caused by Unconventional Viruses. pág. 2289-2324 en: Virology, Fields, ed. Nueva York: Raven Press, Ltd.) . Las encefalopatías espongiformes transmisibles se caracterizan por las mismas evidencias: la presencia de la conformación anómala (resistente a proteinasa K, rica en beta) de la proteína priónica que transmite la enfermedad cuando se inocula de forma experimental a animales de laboratorio incluyendo primates, roedores y ratones transgénicos.

Recientemente, la rápida propagación de encefalopatía espongiforme bovina y su correlación con la elevada aparición de encefalopatías espongiformes en seres humanos ha conducido a un aumento significativo del interés en la detección de encefalopatías espongiformes transmisibles en mamíferos no humanos. Las trágicas consecuencias de la transmisión accidental de estas enfermedades, (véase, por ejemplo, Gajdusek, Infectious Amyloids, y Prusiner Prions en Fields Virology. Fields, y col., eds. Lippincott-Ravin, Pub. Philadelphia (1996) ; Brown y col. (1992) Lancet,

340: 24-27) , dificultades de descontaminación (Asher y col. (1986) páginas 59-71 E: Laborator y Safety: Principles and Practices, Miller ed. Am. Soc. Microb.) , y la reciente preocupación acerca de la encefalopatía espongiforme bovina (British Med. J. (1995) 311: 1415-1421) subrayan la urgencia para tener tanto un ensayo de diagnóstico que identificaría seres humanos y animales con encefalopatías espongiformes transmisibles como terapias para sujetos infectados.

Los priones son el patógeno infeccioso que provoca encefalopatías espongiformes (enfermedades priónicas) . Los priones difieren significativamente de bacterias, virus y viroides. La hipótesis dominante es que, a diferencia de todos los demás patógenos infecciosos, la infección está provocada por una conformación anómala de la proteína priónica, que actúa como un molde y convierte las conformaciones priónicas normales en conformaciones anómalas. Se caracterizó por primera vez una proteína priónica a principios de los años 80 (véase, por ejemplo, Bolton, McKinley y col. (1982) Science 218: 309-1311; Prusiner, Bolton y col. (1982) Biochemistr y 21: 942-6950; McKinley, Bolton y col. (1983) Cell 35: 57-62) . Desde entonces los genes que codifican la proteína priónica completa se han clonado, secuenciado y expresado en animales transgénicos. Véase, por ejemplo, Basler, Oesch y col. (1986) Cell 46: 417

428.

La característica clave de las enfermedades priónicas es la formación de una proteína de forma anómala (PrPSc) , también denominada proteína de tembladera, a partir de la forma normal (celular o no patógena) de proteína priónica (PrPSc) . Véase, por ejemplo, Zhang y col. (1997) Biochem. 36 (12) : 3543-3553; Cohen y Prusiner (1998) Ann Rev. Biochem. 67: 793-819; Pan y col. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 10962-10966; Safar y col. (1993) J Biol Chem

268: 20276-20284. Los estudios de espectroscopía óptica y cristalografía han revelado que las formas relacionadas con enfermedad de priones están sustancialmente enriquecidas en estructura de lámina beta en comparación con las formas no de enfermedad plegadas predominantemente de forma alfa-helicoidal. Véase, por ejemplo, Wille y col. (2001) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 99: 3563-3568; Peretz y col. (1997) J. Mol. Biol. 273: 614-622; Cohen y Prusiner, Capítulo 5: Structural Studies of Prion Proteins en PRION BIOLOGY AND DISEASES, ed. S. Prusiner, Cold Spring Harbor Laborator y Press, 1999, pág. 191-228) . Los cambios estructurales parecen seguirse de alteraciones en las propiedades bioquímicas: PrPC es soluble en detergentes no desnaturalizantes, PrPSc es insoluble; PrPC se digiere

fácilmente por proteasas, mientras que PrpDSc es parcialmente resistente, lo que da como resultado la formación de un fragmento truncado en el extremo N terminal conocido como “PrPres” (Baldwin y col. (1995) ; Cohen y Prusiner (1995) ) , “PrP 27-30” (27-30 kDa) o forma “resistente a PK” (resistente a proteinasa K) . Además, PrPSc puede convertir PrPC a la conformación patógena. Véase, por ejemplo, Kaneko y col. (1995) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 92: 11160-11164; Caughey (2003) Br Med Bull. 66: 109-20.

La detección de las isoformas patógenas de proteínas de enfermedad conformacional en sujetos vivos y muestras obtenidas de sujetos vivos ha resultado difícil. Por lo tanto, el diagnóstico definitivo y los tratamientos paliativos para estas afecciones transmisibles y que contienen amiloide antes de la muerte del sujeto siguen siendo un reto sustancialmente no superado. El examen histopatológico de biopsias del cerebro es arriesgado para el sujeto y pueden pasarse por alto lesiones y depósitos amiloides dependiendo de donde se tome la muestra de biopsia. Sin embargo, aún existen riesgos implicados en las biopsias para animales, pacientes y personal de cuidados sanitarios. Además, los resultados de ensayos cerebrales en animales habitualmente no se obtienen hasta que el animal ha entrado en el suministro alimentario. Además, los anticuerpos generados contra péptidos priónicos reconocen tanto PrPSc desnaturalizado como PrPC pero son incapaces de reconocer de forma selectiva PrPSc infeccioso (desnaturalizado) . (Véase, por ejemplo, Matsunaga y col. (2001) PROTEINS: Structure, Function and Genetics 44: 110-118) .

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de composiciones y procedimientos para detectar la presencia de proteínas priónicas patógenas en diversas muestras, por ejemplo en muestras obtenidas de sujetos vivos, en muestras sanguíneas, en animales de granja y en otros suministros alimentarios humanos y animales. Además, sigue existiendo la necesidad de procedimientos y composiciones para diagnosticar y tratar enfermedades relacionadas con priones.

Sumario de la invención La invención proporciona un reactivo peptídico aislado que interacciona preferentemente con PrPSc en comparación con PrPC, siendo dicho reactivo peptídico un péptido seleccionado del grupo que consiste en péptidos que tienen SEC ID Nº: 12, 14-15, 22, 26-31, 33-37, 39-43, 45-48, 50-63, 65-69, 71-73, 77, 81-82, 84-85, 87-94, 96-101 y 103132 o un análogo o derivado de los mismos, en el que dicho derivado tiene una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones, incluyendo opcionalmente modificaciones después de la expresión del polipéptido.

La invención proporciona un procedimiento para detectar la presencia de un prión patógeno en una muestra que comprende: (a) poner en contacto una muestra sospechosa de contener un prión patógeno con un primer reactivo peptídico de la invención en condiciones que permitan la unión del primer reactivo peptídico con la proteína priónica... [Seguir leyendo]

1. Un reactivo peptídico aislado que interacciona preferentemente con PrPSc en comparación con PrPC, en el que dicho reactivo peptídico es un péptido seleccionado del grupo que consiste en péptidos que tienen SEC ID Nº: 12, 14-15, 22.

2. 31.

3. 37.

3. 43.

4. 48.

5. 63.

6. 69.

7. 73, 77.

8. 82.

8. 85.

8. 94.

9. 101 .

10. 132 o un análogo o derivado de los mismos, en el que dicho derivado tiene una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones, y que incluye opcionalmente modificaciones después de la expresión del polipéptido.

2. El reactivo peptídico de la reivindicación 1, en el que el reactivo peptídico contiene un motivo de hélice de poliprolina de tipo II.

3. El reactivo peptídico de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el reactivo peptídico contiene el motivo de secuencia PXXP, en el que P es una prolina o un una glicina N sustituida y X es cualquier aminoácido.

4. El reactivo peptídico de la reivindicación 1, en el que dicho reactivo peptídico está codificado genéticamente.

5. El reactivo peptídico de cualquier reivindicación precedente, en el que el reactivo peptídico es un péptido seleccionado del grupo que consiste en péptidos que tienen SEC ID Nº: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131, 132, 56, 57, 65, 82 y 84 o un análogo o derivado de los mismos, en los que dicho derivado tiene una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones, y que incluye opcionalmente modificaciones después de la expresión del polipéptido.

6. El reactivo peptídico de cualquier reivindicación precedente, en el que el reactivo peptídico es un péptido seleccionado del grupo que consiste en péptidos que tienen SEC ID Nº: 66, 67, 68, 72, 81, 96, 97, 98, 107, 108, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 y 127 o un análogo o derivado de los mismos, en el que dicho derivado tiene una

o más sustituciones, adiciones y/o deleciones, y que incluye opcionalmente modificaciones después de la expresión del polipéptido.

7. El reactivo peptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el reactivo peptídico es un péptido seleccionado del grupo que consiste en péptidos que tienen SEC ID Nº: 14, 35, 36, 37, 40, 50, 51, 77, 89, 100, 101, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 128, 129, 130, 131 y 132 o un análogo o derivado de los mismos, en el que dicho derivado tiene una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones, y que incluye opcionalmente modificaciones después de la expresión del polipéptido.

8. El reactivo peptídico de cualquier reivindicación precedente, en el que el reactivo peptídico incluye la secuencia de aminoácidos (G) n, en la que n=1, 2, 3 o 4, en el extremo N terminal y/o en el extremo C terminal.

9. El reactivo peptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 7-8, en el que el reactivo peptídico es un péptido seleccionado del grupo que consiste en péptidos que tienen SEC ID Nº: 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 129, 130, 131 y 132 o un análogo o derivado de los mismos, en el que dicho derivado tiene una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones, y que incluye opcionalmente modificaciones después de la expresión del polipéptido.

10. El reactivo peptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 8, en el que el reactivo peptídico es un péptido seleccionado del grupo que consiste en péptidos que tienen SEC ID Nº: 56, 57, 65, 82 y 84 o un análogo o derivado de los mismos, en el que dicho derivado tiene una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones, y que incluye opcionalmente modificaciones después de la expresión del polipéptido.

11. El reactivo peptídico de la reivindicación 1, en el que dicho reactivo peptídico es de entre 3 y 100 restos de longitud y es un péptido que tiene la secuencia SEC ID Nº: 68 o un análogo o derivado del mismo, en el que dicho derivado tiene una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones, y que incluye opcionalmente modificaciones después de la expresión del polipéptido.

12. El reactivo peptídico de la reivindicación 11, en el que el reactivo peptídico comprende un péptido o peptoide que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 66, 67, 72.

9. 98.

10. 108.

11. 126.

13. El reactivo peptídico de cualquier reivindicación precedente, en el que uno o más restos se reemplaza con un análogo de aminoácido.

14. El reactivo peptídico de cualquier reivindicación precedente, en el que el reactivo peptídico comprende uno o más restos de glicina N sustituidos.

15. El reactivo peptídico de cualquier reivindicación precedente, en el que uno o más restos de prolina se sustituyen con restos de glicina N sustituidos.

16. El reactivo peptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, 8-9 y 12, en el que el reactivo peptídico comprende una secuencia seleccionada de SEC ID Nº.

11. 122.

17. El reactivo peptídico de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho reactivo peptídico es:

(a) de 6 a 10 restos de longitud;

(b) de 11 a 20 restos de longitud; o

(c) de 21 a 75 restos de longitud.

18. El reactivo peptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en el que el reactivo peptídico está biotinilado.

19. Un polinucleótido que codifica un reactivo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10.

20. Un complejo que comprende el reactivo peptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y una proteína 10 priónica patógena.

21. Un procedimiento para detectar la presencia de un prión patógeno en una muestra que comprende:

(a) poner en contacto una mezcla sospechosa de contener un prión patógeno con un primer reactivo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 en condiciones que permitan la unión del primer reactivo peptídico con la proteína priónica patógena, si está presente, para formar un primer

complejo; y

(b) detectar la presencia del prión patógeno, si lo hubiera, en la muestra por su unión con un reactivo peptídico.

22. Un procedimiento para detectar la presencia de un prión patógeno en una muestra que comprende:

(a) poner en contacto una mezcla sospechosa de contener un prión patógeno con un primer reactivo de unión a prión en condiciones que permitan la unión del primer reactivo de unión a prión con la proteína priónica patógena, si está presente, para formar un primer complejo;

(b) que comprende opcionalmente una o ambas de las etapas de:

i) retirar materiales de muestra no unidos; y ii) disociar dicho prión patógeno de dicho primer complejo;

(c) poner en contacto de ese primer complejo o prión patógeno disociado con un segundo reactivo de unión a prión en condiciones que permitan la unión del segundo reactivo de unión a prión con el prión patógeno, en el que dicho segundo reactivo de unión a prión comprende un marcador detectable; y

(d) detectar la presencia del prión patógeno, si lo hubiera, en la muestra por su unión con el segundo reactivo peptídico;

en el que en el primer y/o el segundo reactivo de unión a prión es un reactivo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que el primer reactivo de unión a prión y/o el segundo reactivo de unión a prión son un anticuerpo antiprión, un polipéptido híbrido con motivo injertado, un polímero catiónico o aniónico, un catalizador de propagación, plasminógeno, o un reactivo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que el primer y segundo reactivos de unión a prión son un reactivo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

25. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que dicho primer reactivo peptídico y dicho segundo reactivo peptídico son diferentes.

26. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que dicho primer reactivo peptídico y dicho segundo reactivo peptídico son iguales.

27. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, en el que dicho primer péptido está biotinilado.

28. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27, en el que el primer reactivo de unión a prión 45 se proporciona en un soporte sólido.

29. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste en nitrocelulosa, látex de poliestireno, fluoruro de polivinilo, papel diazotizado, membranas de nailon, perlas activadas y perlas magnéticamente sensibles.

30. El procedimiento de la reivindicación 28 o reivindicación 29, que comprende las etapas de:

(a) combinar el soporte sólido con un primer ligando marcado de forma detectable, en el que la afinidad de

unión del primer reactivo peptídico con el primer ligando marcado de forma detectable es más débil que la afinidad de unión del primer reactivo peptídico con un prión patógeno;

(b) combinar una muestra con el soporte sólido en condiciones que permitan que un prión patógeno, cuando está presente en la muestra, se una al primer reactivo peptídico y reemplace el primer ligando; y 5 (c) detectar complejos formados entre el primer reactivo peptídico y el prión patógeno de la muestra.

31. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 30, en el que la muestra es una muestra biológica.

32. El procedimiento de la reivindicación 31, en el que la muestra biológica está seleccionada del grupo que consiste en órganos, sangre completa, fracciones de sangre, componentes de sangre, plasma, plaquetas, suero, líquido

cefalorraquídeo (LCR) , tejido cerebral, tejido del sistema nervioso, tejido muscular, médula ósea, orina, lágrimas, tejido de sistema no nervioso, órganos y/o biopsias o necropsias.

33. El procedimiento de la reivindicación 32, en el que la muestra biológica es sangre completa, plasma, plaquetas, fracciones de sangre o suero.

34. Un soporte sólido que comprende al menos un reactivo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las 15 reivindicaciones 1 a 18.

35. Un kit para detectar de la presencia de un prión patógeno en una muestra que comprende:

(a) un soporte sólido de acuerdo con la reivindicación 34; y

(b) otros reactivos necesarios, y,

(c) opcionalmente, controles positivos y negativos.

36. Un reactivo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para su uso como un medicamento.

37. El uso de un reactivo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedad priónica.

38. El uso de la reivindicación 37, en el que la enfermedad priónica es en un mamífero.

39. El uso de la reivindicación 38, en el que el mamífero es un ser humano.

40. Una composición que comprende un reactivo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

41. Una composición que comprende el polinucleótido de la reivindicación 19.

42. La composición de la reivindicación 40 o reivindicación 41, en el que la composición está adaptada para

administrarse por vía intramuscular, intramucosa, intranasal, subcutánea, intradérmica, transdérmica, intravaginal, intrarrectal, oral o intravenosa.

43. El uso de un reactivo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un paciente que se ha tratado previamente con al menos un medicamento de la reivindicación 36, para el tratamiento o prevención de enfermedad priónica.

44. Un procedimiento para aislar una proteína priónica patógena de una muestra que comprende:

(a) proporcionar un soporte sólido que comprende un reactivo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18;

(b) poner en contacto dicha muestra con dicho soporte sólido en condiciones que permitan la unión de una

proteína priónica patógena, si está presente en dicha muestra, con dicho primer reactivo peptídico, para 40 formar un primer complejo; y

(c) retirar materiales de muestra no unidos.

45. El procedimiento de la reivindicación 44, que comprende además la etapa de disociar dicha proteína priónica patógena de dicho primer complejo.

46. Un procedimiento para eliminar proteínas priónicas patógenas de una muestra que comprende:

(a) proporcionar un soporte sólido que comprende un reactivo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18;

(b) poner en contacto dicho soporte sólido con una muestra sospechosa de contener proteínas priónicas patógenas en condiciones que permitan la unión de las proteínas priónicas patógenas, si están presentes, con el reactivo peptídico; y

(c) recuperar los materiales de muestra no unidos.

47. Un procedimiento para preparar suministro de sangre que esté sustancialmente sin priones patógenos, comprendiendo dicho suministro de sangre, sangre completa, plasma, plaquetas o suero, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) explorar alícuotas de sangre completa, plasma, plaquetas o suero de muestras de sangre recogidas, por 5 el procedimiento de la reivindicación 21;

(b) eliminar muestras en las que se detecten priones patógenos, y

(c) combinar muestras en las que no se detecten priones patógenos para proporcionar un suministro de sangre que esté sustancialmente sin priones patógenos.

48. Un procedimiento para preparar suministro de alimentos que esté sustancialmente sin priones patógenos, 10 comprendiendo dicho procedimiento:

(a) explorar una muestra recogida de organismos vivos que entrarán en el suministro de alimentos o una muestra recogida de alimentos que se pretende que entren en el suministro de alimentos, por el procedimiento de la reivindicación 20;

(b) eliminar muestras en las que se detecten priones patógenos; y

(c) combinar muestras en las que no se detecten priones patógenos para proporcionar un suministro de alimentos que esté sustancialmente sin priones patógenos.

FIGURA 1 SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS DE PRIÓN

Secuencia de aminoácidos de una proteína priónica humana de longitud completa

Secuencia de aminoácidos de una proteína priónica de ratón de longitud completa