Reactivos de diagnóstico y métodos para su uso.

Un reactivo de diagnOstico, que comprende un soporte said° y un lipido bioactivo derivabzado asociado a 61,

enel que el lipido bioactivo derivatizado comprende un grupo de cabeza polar y al menos una cadena hidrocarbonadaen el que un atomo de carbon dent° de la al menos una cadena hidrocarbonada esta derivatizado con un gaily)sulfhidrilo colgante y en el que el lipido bioactivo se selecciona del grupo que consiste en un esfingolipido, unmetabolito de esfingolipido, un add° lisofosfatidico y un precursor del acido lisofosfatidico, en el que el esfingolipidoy el metabolito de esfingolipido se seleccionan del grupo que consiste en ceramida, ceramida-1-fosfato,N-acetilceramida-1-fosfato, esfinganina, esfingosilfosforilcolina (SPC), dihidroesfingosina, dihidroesfingosina-1-fosfato, y esfingosina-1-fosfato (S1P), en el que el lipid° bioactivo esta asociado con el soporte solid° a traves delgrupo sulfhidrilo.

Reaclivos de diagnóstico y métodos para su uso La presente invención describe anticuerpos monodonales y métodos para generar anticuerpos contra inmunógenos que comprenden una molécula lipfdica bioactiva que desempeña un papel en enfermedades humanas ylo animales como molécula de señalización. Una ciase concreta de lipidos bioactivos de señalización a la que se puede aplicar

la invención son los lisolípidos. Los lisolipidos de señalización particularmente preferidos son la esfingosina-1-fosfato (S1 P) y los diversos ácidos lisofosfatídicos (LPA) . Los anticuerpos descritos en la presente pueden modificarse aún más para que sean adecuados para su uso en especies animales concretas, que incluyen al ser humano, sin provocar una respuesta inmunológica neutralizante. Estos anticuerpos y sus derivados y variantes, pueden utilizarse para el tratamiento y/o la prevención de diversas enfermedades o trastornos por medio de la administración de composiciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos, solos o en combinación con otros agentes terapéuticos y/o tratamientos. Además, los anticuerpos también pueden utilizarse para detectar lípidos de señalización bioactivos en muestras biológicos, proporcionando con ello información útil para muchos fines que incluyen, pero no se limitan al diagnóstico y/o la prognosis de enfermedades y el descubrimiento y el desarrollo de nuevas modalidades de tratamientos que modifiquen la producción y/o las acciones del lípido diana concreto. Las enfermedades o los trastornos que se verán afectados por las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a enfermedades que presentan hiperproliferación, angiogénesis, inflamación, fibrosis ylo apoptosis como parte de su patología subyacente.

Antecedentes de la invención 1. Antecedentes A. Upidos de señalización bioactivos Los lípidos y sus derivados se reconocen ahora como importantes dianas para la investigación médica, no sólo como simples elementos estructurales en las membranas celulares, agentes solubilizantes, materia prima para vitaminas u hormonas, o como fuente de energía para la p-oxidación, la glic6lisis u otros procesos metabólicos. En concreto, ciertos lípidos bioactivos actúan como mediadores de la señalización importantes en enfermedades de animales y seres humanos. Aunque la mayoría de los lípidos en la membrana plasmática desempeñan un papel exclusivamente estructural, una pequeña proporción está implicada en transmitir estímulos extracelulares hacia el interior de las células. La "señalización de lípidos" se refiere a cualquiera de una serie de vías de transducción de señales celulares que emplean lípidos bioactivos como primer o segundo mensajero, incluyendo la interacción directa de una molécula de señalización lipídica con su propio receptor especifico. Las vías de señalización lipidicas son activadas por una diversidad de estfmulos extracelulares, que varían desde factores del crecimiento a citoquinas inflamatorias y regulan las decisiones del destino de la célula, tales como la apoptosis, la diferenciación y la proliferación. La investigación de la señalización de lípidos bioactivos es un área de intensa investigación científica a medida que se van identificando cada vez más lipidos bioactivos y se caracterizan sus acciones.

Los ejemplos de lipidos bioactivos incluyen los eicosanoides derivados del ácido araquidónico (que incluyen los metabolitos de eicosanoides, tales como los HETE, cannabinoides, leucotrienos, prostaglandinas, lipoxinas, ácidos epoxieicosatrienoicos, e isoeicosanoides) , mediadores de cannabinoides no eicosanoides, fosfolípidos y sus derivados, tales como ácido Iosfatídico (PA) y Iosfatidilglicerol (PG) y cardiolipinas, así como lisofosfolípidos, tales como lisolosfatidilcolina (LPC) y diversos acidos lisolosfatídicos (LPA) . Los mediadores lipídicos de señalización bioactivos también incluyen los esfingolipidos, tales como ceramida, ceramida-1-fosfato, esfingosina, esfinganina,

esfingosilfoslorilcolina (SPC) y esfingosina-1-fosfato (S1 P) . Los esfingolípidos y sus delÍvados representan un grupo de moléculas de señalización extracelular e intracelular con efectos pleiotrópicos sobre importantes procesos celulares. Otros ejemplos de lípidos de señalización bioactivos incluyen fosfatidilinositol (PI) , fosfatidiletanolamina (PEA) , diacilglicérido (DG) , sulfatidas, gangliósidos y cerebrósidos.

Tal como se esperaría, los lipidos biológicos (es decir, los lípidos que aparecen en la naturaleza, en particular en organismos vivos) generalmente son no inmunogénicos o son muy débilmente inmunogénicos. Como tales, los lipidos se han considerado tradicionalmente como dianas inapropiadas para las estrategias terapéuticas y de diagnóstico/prognosis basadas en anticuerpos. La bibliografía contiene un informe acerca de un anticuerpo monoclonal que se dirige a una forma derivatizada de fosfatidilserina (PS) , conjugado con una protelna portadora. La fosfatidilserina es un aminolosfolípido de la membrana plasmática. La pérdida de la orientación hacia el interior o el

exterior del lípido de membrana, en particular la emergencia de la fosfatidilserina a la superficie celular, da como resultado la expresión de propiedades alteradas de la superficie que modulan la función celular e influyen en la interacción de las células con su entorno (Zwaal y Schroit (1997) , Blood, 89:1121-1132) . Por ejemplo, la PS se redistribuye desde la cara interna de la membrana celular (su emplazamiento normal) hacia la cara externa durante la apoptosis.

Diaz, Balasubramanian y Schoirt (Bioconj. Chem. (1998) , 9:250-254) describen la producción de antígenos lipídicos que provocan respuestas inmunológicas espeCíficas contra la PS. El acoplamiento covalente de la PS a un portador proteico (BSA) a través de la cadena lateral de acilo graso del lípído conserva intacto el grupo de cabeza de la PS como epitopo. Schroit (patente de EEUU 6.300.308, patente de EEUU 6.806.354) describe anticuerpos que se unen de modo específico a la fosfatidilserina (PS) o a un conjugado de fosfatidilcolina (PC) /polipéptido o de PS/polipéptido, que se forman administrando un conjugado de PS/polipéptido o un conjugado de PC/polipéptido a un animal. También se describen métodos para detectar PS, un conjugado de PC/polipéptido o de PS/polipéptido.

También se describen métodos para fabricar un anticuerpo que se une de modo especifico a PS mediante la administración a un animal de una composición farmacéutica que comprende una composición de conjugado de PS/polipéptido, así como métodos para tratar el cáncer en el animal al cual se administra el conjugado, es decir, como una vacuna del cáncer. También se describe la inducción de autoinmunidad para la terapia del cáncer

mediante la inmunización de animales con complejos de ~2-glicoproteína l/lípido (es decir, lipido y glicoproteína con asociación no covalente) . Los autores afirman que se dirigen varias respuestas autoinmunológicas contra los complejos de ~2-glicoproteína l/lípido (citando a Schousboe (1979) , Biochim. Biophys. Acta, 579:396-408) y asi la generación de una respuesta anti-complejo puede representar un avance muy importante en el tratamiento de cánceres.

Thorpe, Schroit el al. describen un anticuerpo monoclonal (3G4) que se une a fosfolípidos aniónicos en presencia de suero o de la proteína serica ~2-glicoproteína I W2-GPI) (Luster el al., J. Biol. Chem., 281 :29863-29871) . Descrito en un primer momento como un anticuerpo que se dirige específicamente a fosfolípidos aniónicos, este anticuerpo se dirige a células endoteliales en tumores de ratones (Ran el al. (2005) , Clin. Cancer Res., 11:1551-1562) .

Posteriormente se demostró que el anticuerpo se une a complejos de fosfolípidos aniónicos y p2-GPI sobre vasos de tumores, de modo que la unión del anticuerpo a PS depende de ~2-GPI (Huang el al. (2005) , Cancer Res., 65:44084416) . El anticuerpo potencia la unión de ~2-GPI a las células endoteliales a través de la dimerización de ~2-GPI. De hecho, los dimeros de ~2-GPI artificiales pueden unirse a las membranas de las células endoteliales incluso en ausencia del anticuerpo (Luster el al., J. Biol. Chem., 281:29863-29871) . Una versión humanizada de 3G4

(tarvacina, bavituximab) se encuentra en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer y de enfermedades víricas.

Thorpe el al. (documento WO 2004/006847) describe anticuerpos, sus fragmentos o inmunoconjugados que se unen a PS y compiten con el anticuerpo 3G4 por la unión a la PS. Thorpe el al. (documentos US 6.818.213, US 6.312.294 y US 6.783.760) describen conjugados terapéuticos que se unen a aminofosfolípidos y tienen un agente terapéutico... [Seguir leyendo]

1. Un reactivo de diagnóstico, que comprende un soporte sólido y un lipido bioactivo derivatizado asociado a él, en el que ellípido bioactivo derivatizado comprende un grupo de cabeza polar y al menos una cadena hidrocarbonada, en el que un átomo de carbon dentro de la al menos una cadena hidrocarbonada está derivatizado con un grupo sulfhidrilo colgante y en el que el lipido bioactivo se selecciona del grupo que consiste en un esfingolipido, un metabolito de esfingolipido, un ácido lisofosfatídico y un precursor del ácído lisofosfatídico, en el que el esfingolipido y el metabolito de esfingolipido se seleccionan del grupo que consiste en ceramida, ceramida-1-fosfato, N-acetilceramida-1-fosfato, esfinganina, esfingosilfosforilcolina (Spe) , dihidroesfingosina, dihidroesfingosina-1fosfato, y esfingosina-1-fosfato (S1P) , en el que ellipido bioactivo está asociado con el soporte sólido a través del

grupo sulfhidrilo.

2. El reactivo de diagnóstico según la reivindicación 1, en el que ellípido bioactivo derivatizado está unido directa o indirectamente al soporte sólido.

3. El reactivo de diagnóstico según la reivindicación 1, en el que el lípida bioactivo derivatizado está unido covalentemente directamente al soporte sólido.

4. El reactivo de diagnóstico según la reivindicación 1, en el que ellipido bioactivo derivatizado está conjugado con un resto portador, en el que dicho resto portador está unido al soporte sólido.

5. El reactivo de diagnóstico según la reivindicación 1, en el que el esfingolipido es esfingosina-1-fosfato.

6. El reactivo de diagnóstico según la reivindicación 4, en el que el resto portador se selecciona del grupo que consiste en una protelna, polietilenglicol, oro coloidal, adyuvantes y esferas de silicona.

7. El reactivo de diagnóstico según la reivindicación 4, en el que el resto portador es una proteína, en el que la proteína se selecciona del grupo que consiste en hemocianina de lapa (KLH) , albúmina, hemaglutinina, toxoide del tétanos y toxoide de la difteria.

8. El reactivo de diagnóstico según la reivindicación 5, en el que el reactivo de diagnóstico es un derivado de sulfhidrilo de esfingosina-1-fosfato unido covalentemente a hemocianina de lapa (KLH) o albúmina.

9. El reactivo de diagnóstico según la reivindicación 1, en el que el reactivo de diagnóstico es un derivado de sulfhidrilo del ácido lisofosfatídico unido covalentemente a hemocianina de lapa (KLH) o albúmina.

10. Un método para detectar en una muestra un resto inmunoderivado que se une a un lipido bioactivo seleccionado, que comprende poner en contacto una muestra con un dispositivo de diagnóstico que porta un reactivo de diagnóstico según la reivindicación 1, bajo condiciones que permiten que el resto inmunoderivado, si está

presente, se una al lipido bioactivo derivatizado del reactivo de diagnóstico, en el que el IIpido bioactivo que está

derivatizado en el reactivo de diagnóstico y ellípido bioactivo seleccionado son el mismo lipido bioactivo.

11. El método según la reivindicación 10, en el que el resto inmunoderivado se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo policlonal; un anticuerpo monodonal; un anticuerpo quimérico; un fragmento de un anticuerpo polidonal, monoclonal o quimérico; un variante de un anticuerpo policlonal, monoclonal o quimérico; un derivado de un anticuerpo polidonal, monoclonal o quimérico; y un autoanticuerpo.

12. El método según la reivindicación 10, en el que ellipido bioactivo derivatizado está unido al soporte sólido.

13. El método según la reivindicación 10, en el que el lipido bioactivo derivatizado está conjugado con un resto portador.

14. El método según la reivindicación 13, en el que el resto portador está unido al soporte sólido.

15. El método según la reivindicación 10, en el que la muestra se deriva de un animal.

16. El método según la reivindicación 15, en el que el animal es un ser humano.

17. El método según la reivindicación 15, en el que la muestra es un fluido corporal o una muestra de tejido.