Composiciones y procedimientos de unión a esfingosina-1-fosfato.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado que se une a esfingosina-1-fosfato (S1P) en condiciones fisiológicas,

en el que:

a. el anticuerpo comprende dos polipéptidos de cadena ligera y dos polipéptidos de cadena pesada, en el que:

(i) cada polipéptido de cadena ligera comprende la primera, segunda, y tercera regiones que determinan la complementariedad CDRL1, CDRL2, y CDRL3, respectivamente, en el que CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos ITTTDIDDDMN (SEC ID Nº: 10); CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos EGNILRP (SEC ID Nº: 11); y CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos LQSDNLPFT (SEC ID Nº: 12); y

(ii) cada polipéptido de cadena pesada comprende la primera, segunda, y tercera regiones que determinan la complementariedad CDRH1, CDRH2, y CDRH3, respectivamente, en el que CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos DHTIH (SEC ID Nº: 13); CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos AISPRHDITKYNEMFRG (SEC ID Nº: 31); y CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos GGFYGSTIWFDF (SEC ID Nº: 15); y

b. el fragmento de anticuerpo tiene un solo sitio de unión a antígeno y comprende un polipéptido de cadena ligera o fragmento del mismo y un polipéptido de cadena pesada o fragmento del mismo, en el que:

(i) el polipéptido de cadena ligera o fragmento del mismo comprende la primera, segunda, y tercera regiones que determinan la complementariedad CDRL1, CDRL2, y CDRL3, respectivamente, en el que CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos ITTTDIDDDMN (SEC ID Nº: 10); CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos EGNILRP (SEC ID Nº: 11); y CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos LQSDNLPFT (SEC ID Nº: 12); y

(ii) el polipéptido de cadena pesada o fragmento del mismo comprende la primera, segunda, y tercera regiones que determinan la complementariedad CDRH1, CDRH2, y CDRH3, respectivamente, en el que CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos DHTIH (SEC ID Nº: 13); CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos AISPRHDITKYNEMFRG (SEC ID Nº: 31); y CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos GGFYGSTIWFDF (SEC ID Nº: 15),

en el que las tres CDR de cadena ligera se injertan en una región marco de cadena ligera humana que contiene las tres mutaciones siguientes en la secuencia de murino: Y49S, G64S, y S67Y, y en el que las tres CDR de cadena pesada se injertan en una región marco de cadena pesada humana que contiene la mutación siguiente en la secuencia V37M de murino, en el que la región marco de cadena ligera es de anticuerpo AY050707 humano y la región marco de cadena pesada humana es de anticuerpo AJ002773 humano.

Composiciones y procedimientos de unión a esfingosina-1-fosfato Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención.

La presente invención se refiere a agentes que se unen a esfingosina-1-fosfato (S1P) particularmente a anticuerpos monoclonales humanizados, fragmentos de anticuerpos, y derivados de anticuerpos específicamente reactivos a S1P en condiciones fisiológicas. Dichos agentes se pueden usar en el tratamiento y/o prevención de diversas enfermedades o trastornos mediante la administración de composiciones farmacéuticas que contienen dichos agentes.

2. Antecedentes.

Lípidos bioactivos de señalización Los lípidos y sus derivados se reconocen en la actualidad como importantes dianas para la investigación médica, no simplemente como elementos estructurales en las membranas celulares o como una fuente de energía para β-oxidación, glucólisis u otros procesos metabólicos. En particular, determinados lípidos bioactivos funcionan como mediadores de señalización importantes en enfermedades animales y humanas. Aunque la mayoría de los lípidos de la membrana plasmática desempeñan un papel exclusivamente estructural, una pequeña proporción de ellos están implicados en la transmisión de estímulos extracelulares en las células. "Señalización de lípidos" se refiere a cualquiera de una serie de rutas de transducción de señales celulares que usan lípidos de la membrane celular como segundos mensajeros, del mismo modo que se refiere a la interacción directa de una molécula de señalización de lípido con su propio receptor específico. Las rutas de señalización de lípidos se activan por una diversidad de estímulos extracelulares, que van desde factores de crecimiento a citoquinas inflamatorias, y regulan las decisiones del destino celular tales como apoptosis, diferenciación y proliferación. La investigación sobre la señalización de lípidos bioactivos es un área de intensa investigación científica a medida que se identifican más y más lípidos bioactivos y se caracterizan sus acciones.

Los ejemplos de lípidos bioactivos incluyen los eicosanoides (incluyendo los cannabinoides, leucotrienos, prostaglandinas, lipoxinas, ácidos epoxieicosatrienoicos, e isoeicosanoides) , mediadores de cannabinoides no eicosanoides, fosfolípidos y sus derivados, tales como ácido fosfatídico (PA) y fosfatidilglicerol (PG) , factor de activación de plaquetas (PAF) y cardiolipinas así como lisofosfolípidos tales como lisofosfatidil de colina (LPC) y diversos ácidos lisofosfatídicos (LPA) . Los mediadores de lípidos bioactivos de señalización también incluyen los esfingolípidos tales como esfingomielina, ceramida, la ceramida-1-fosfato, esfingosina, colina esfingosilfosforilo, esfinganina, esfinganina-1-fosfato (Dihidro-SIP) y esfingosina-1-fosfato. Los esfingolípidos y sus derivados representan un grupo de moléculas de señalización extracelular e intracelular con efectos pleiotrópicos en los procesos celulares importantes. Otros ejemplos de lípidos bioactivos de señalización incluyen fosfatidilserina (PS) , fosfatidilinositol (PI) , fosfatidiletanolamina (PEA) , diacilglicérido (DG) , sulfátidos, gangliósidos, y cerebrósidos.

Los esfingolípidos son una clase única de lípidos que se llamaron así, debido a su carácter inicialmente misterioso, por la Esfinge. Los esfingolípidos se caracterizaron inicialmente como componentes estructurales primarios de las membranas celulares, pero estudios recientes indican que los esfingolípidos también sirven como moléculas de señalización y de regulación celular (Hannun, y col., Adv. Lipid Res. 25: 27-41, 1993; Speigel, y col., FASEB J. 10: 1388-1397, 1996; Igarashi, J. Biochem 122: 1080-1087, 1997; Hla, T. (2004) . Semin Cell Dev Biol, 15, 513-2; Gardell, S.E., Dubin, A.E. y Chun, J. (2006) . Trends Mol Med, 12, 65-75) . Los esfingolípidos son componentes estructurales primarios de las membranas celulares que también sirven como la señalización celular y de regulación celular (Hannun y Bell, Adv. Lipid Res. 25: 27-41, 1993; Igarashi, J. Biochem 122: 1080-1087, 1997) . Los esfingolípidos mediadores de la señalización, ceramida (CER) , esfingosina (SPH) y esfingosina-1-fosfato (S1P) , se han estudiado más ampliamente y se han valorado recientemente por sus papeles en el sistema cardiovascular, angiogénesis y biología tumoral (Claus, y col, Curr Drug Targets 1: 185-205, 2000; Levade, y col, Circ. Res. 89: 957-968, 2001; Wang, y col, J. Biol. Chem. 274: 35343-50, 1999; Wascholowski y Giannis, Drug News Perspect. 14: 581-90, 2001; Spiegel, S. y Milstien, S. (2003) . Sphingosine-1-phosphate: an enigmatic signaling lipid. Nat Rev Mol Cell Biol, 4, 397-407; documento de patente US 6534323) .

Para una revisión del metabolismo de los esfingolípidos, véase Liu, y col, Crit Rev. Clin. Lab. Sci. 36: 511-573, 1999. Para revisiones de la ruta de señalización de la esfingomielina, véase Hannun, y col, Adv. Lipid Res. 25: 27-41, 1993; Liu, y col, Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 36: 511-573, 1999; Igarashi, J. Biochem. 122: 1080-1087, 1997; Oral, y col., J. Biol. Chem. 272: 4836-4842, 1997; y Spiegel y col, Biochemistr y (Moscú) 63: 69-83, 1998.

S1P es un mediador de la proliferación celular y protege de la apoptosis mediante la activación de las rutas de supervivencia (Maceyka, y col. (2002) , BBA, vol. 1585) : 192-201, y Spiegel, y col. (2003) , Nature Reviews Molecular Cell Biology, vol. 4: 397-407) . Se ha propuesto que el equilibrio entre los niveles de CER/SPH y S1P proporciona un mecanismo de reóstato que decide si una célula se dirige a la ruta de la muerte o se protege de la apoptosis. La enzima reguladora clave del mecanismo de reóstato es la esfingosina quinasa (SPHK) cuya función es convertir los lípidos

bioactivos de señalización que promueven la muerte (CER/SPH) en el S1P que promueve el crecimiento. S1P tiene dos destinos: S1P se puede degradar por S1P liasa, una enzima que escinde S1P a fosfoetanolamina y hexadecanal, o, menos común, se hidroliza por la S1P fosfatasa a SPH.

Las actividades biológicas pleiotrópicas de S1P mediaban a través de una familia de receptores acoplados a proteínas G (GPCR) conocidos originalmente como Genes de Diferenciación Endotelial (EDG) . Se han identificado cinco GPCR como receptores S1P de alta afinidad (S1PR) : S1P1/EDG-1, S1P2/EDG-5, S1P3/ EDG-3, S1P4/EDG-6, y S1P5/ EDG-8 solo identificado tan tarde como en 1998 (Lee, y col., 1998) . Muchas de las respuestas evocadas por S1P se acoplan a diferentes proteínas G heterotriméricas (Gq-, Gi, G-12-13) y las pequeñas GTPasas de la familia Rho (Gardell, y col., 2006) .

En el adulto, S1P se libera de las plaquetas (Murata y col., 2000) y mastocitos para crear un pulso local de S1P libre (suficiente para superar la Kd de los S1PR) para promover la cicatrización de heridas y participar en la respuesta inflamatoria. En condiciones normales, la S1P total en el plasma es bastante elevada (300-500 nM) ; sin embargo, se ha planteado la hipótesis de que la mayoría de la S1P se puede ’tamponar’ por las proteínas séricas, en particular lipoproteínas (por ejemplo, HDL> LDL> VLDL) y albúmina, de modo que la S1P biodisponible (o la fracción libre de S1P) no es suficiente para activar apreciablemente las S1PR (Murata y col., 2000) . Si este no fuera el caso, aparecería una angiogénesis e inflamación inapropiadas. Además, se han sugerido acciones intracelulares de S1P (véase, por ejemplo, Spiegel S, Kolesnick R (2002) , Leukemia, vol. 16: 1596-602; Suomalainen, y col (2005) , Am J Pathol, vol. 166: 773-81) .

Una amplia expresión de los receptores de S1P de la superficie celular permite que S1P incluya en un amplio espectro de respuestas celulares, e incluye proliferación, adhesión, contracción, motilidad, morfogénesis, diferenciación y supervivencia. Parece que este espectro de respuestas depende de los patrones de expresión de solapamiento o distintos de los receptores de S1P en los sistemas de células y tejidos. Además, se ha demostrado recientemente la interferencia entre las rutas de señalización de S1P y del factor de crecimiento de, incluyendo el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , y factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) (véase, por ejemplo, Baudhuin, y col. (2004) , FASEB J, vol. 18: 341-3) . La regulación de diversos procesos celulares que implican S1P tiene un impacto en particular en la señalización neuronal, tono vascular, curación de heridas, tráfico de células inmunes, reproducción y función cardiovascular, entre otros. Las alteraciones de los niveles endógenos de S1P dentro de estos sistemas pueden tener efectos perjudiciales, provocando varias afecciones fisiopatológicas, que incluyen cáncer,... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado que se une a esfingosina-1-fosfato (S1P) en condiciones fisiológicas, en el que:

a. el anticuerpo comprende dos polipéptidos de cadena ligera y dos polipéptidos de cadena pesada, en el que:

(i) cada polipéptido de cadena ligera comprende la primera, segunda, y tercera regiones que determinan la complementariedad CDRL1, CDRL2, y CDRL3, respectivamente, en el que CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos ITTTDIDDDMN (SEC ID Nº : 10) ; CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos EGNILRP (SEC ID Nº : 11) ; y CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos LQSDNLPFT (SEC ID Nº : 12) ; y

(ii) cada polipéptido de cadena pesada comprende la primera, segunda, y tercera regiones que determinan la complementariedad CDRH1, CDRH2, y CDRH3, respectivamente, en el que CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos DHTIH (SEC ID Nº : 13) ; CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos AISPRHDITKYNEMFRG (SEC ID Nº : 31) ; y CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos GGFYGSTIWFDF (SEC ID Nº : 15) ; y

b. el fragmento de anticuerpo tiene un solo sitio de unión a antígeno y comprende un polipéptido de cadena ligera o 15 fragmento del mismo y un polipéptido de cadena pesada o fragmento del mismo, en el que:

(i) el polipéptido de cadena ligera o fragmento del mismo comprende la primera, segunda, y tercera regiones que determinan la complementariedad CDRL1, CDRL2, y CDRL3, respectivamente, en el que CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos ITTTDIDDDMN (SEC ID Nº : 10) ; CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos EGNILRP (SEC ID Nº : 11) ; y CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos LQSDNLPFT (SEC

ID Nº : 12) ; y

(ii) el polipéptido de cadena pesada o fragmento del mismo comprende la primera, segunda, y tercera regiones que determinan la complementariedad CDRH1, CDRH2, y CDRH3, respectivamente, en el que CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos DHTIH (SEC ID Nº : 13) ; CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos AISPRHDITKYNEMFRG (SEC ID Nº : 31) ; y CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos GGFYGSTIWFDF (SEC ID Nº : 15) , en el que las tres CDR de cadena ligera se injertan en una región marco de cadena ligera humana que contiene las tres mutaciones siguientes en la secuencia de murino: Y49S, G64S, y S67Y, y en el que las tres CDR de cadena pesada se injertan en una región marco de cadena pesada humana que contiene la mutación siguiente en la secuencia V37M de murino, en el que la región marco de cadena ligera es de anticuerpo AY050707

humano y la región marco de cadena pesada humana es de anticuerpo AJ002773 humano.

2. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que:

a. la cadena o cadenas pesadas o fragmento de las mismas del anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprenden un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de restos de aminoácidos que tienen una 35 secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en:

(i)

y

(ii) una secuencia de restos de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 80 % con la secuencia de aminoácidos de a (i) , mencionada anteriormente; y

b. la cadena o cadenas ligeras o fragmento de las mismas del anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de restos de aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en:

(i)

y

(ii) una secuencia de restos de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 80 % con la secuencia de aminoácidos de b (i) , mencionada anteriormente.

3. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que:

a. la cadena o cadenas pesadas del anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de restos de aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en:

(i)

en la que el resto de K (lisina) C-terminal es opcional; y

(ii) una secuencia de restos de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 80 % con la secuencia de aminoácidos de a (i) , mencionada anteriormente; y

b. la cadena o cadenas ligeras del anticuerpo o fragmento de anticuerpos comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de restos de aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre 15 el grupo que consiste en:

(i)

y

(ii) una secuencia de restos de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 20 aproximadamente un 80 % con la secuencia de aminoácidos de b (i) , mencionada anteriormente.

4. Un anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 1 seleccionado entre el grupo que consiste en un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, y un anticuerpo madurado por afinidad.

5. Un fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 1 seleccionado entre el grupo que consiste en un fragmento de Fv, un fragmento de Fv de una sola cadena, un fragmento de Fab, y un fragmento de Fab’.

6. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que:

a. el dominio variable de cadena pesada tiene la secuencia codificada por el gen de cadena pesada en el vector pATH1009 en StB12 de E. coli, depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo con el Nº de Acceso de la ATCC PTA-8421, y el dominio variable de cadena ligera tiene la secuencia codificada por el gen de cadena ligera en el vector pATH1009 en StB12 de E. coli, depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo con el Nº de Acceso de la ATCC PTA-8421; o b. el dominio variable de cadena pesada tiene la secuencia codificada por la cadena pesada en el vector pATH1009 en la línea celular de CHO LH1 275, depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo con el Nº de Acceso de la ATCC PTA-8422; y el dominio variable de cadena ligera tiene la secuencia codificada por la cadena ligera en el vector pATH1009 en la línea celular de CHO LH1 275, depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo con el Nº de Acceso de la ATCC PTA-8422,

7. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo contiene un sitio de glicosilación.

8. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. Un artículo que comprende una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8 envasado en un recipiente, y que además comprende opcionalmente instrucciones de uso.

10. Una composición de ácido nucleico aislado que codifica la expresión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la composición comprende:

a. un primer casete de expresión que comprende un promotor y un gen que codifica el polipéptido o polipéptidos de cadena pesada del anticuerpo o fragmento de anticuerpo; y

b. un segundo casete de expresión que comprende un promotor y un gen que codifica el polipéptido polipéptidos de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

11. Una composición de ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 10, en la que la composición comprende un plásmido que comprende el primer y segundo casetes de expresión.

12. Una célula huésped recombinante transfectada con una composición de ácido nucleico aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-11 y que es capaz de expresar dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

13. Un procedimiento de producción de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende el cultivo de una célula huésped recombinante capaz de producir el anticuerpo en un medio de cultivo celular y aislar el anticuerpo.

14. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto, en el que dicha enfermedad trastorno se correlaciona con un nivel anómalo de S1P.

15. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado para su uso de acuerdo con la reivindicación 14 en la que la enfermedad o trastorno se caracteriza, al menos en parte, por neovascularización, angiogénesis, proliferación de células endoteliales, fibrogénesis, fibrosis, cicatrización, inflamación, o respuesta inmune anómalas.