Reacción de amplificación de extensión y mellado para la amplificación exponencial de los ácidos nucleicos.

Procedimiento para amplificar una secuencia diana ácido nucleica bicatenaria,

que comprende las etapas siguientes: a) poner en contacto una molécula de ADN diana, que comprende una secuencia diana bicatenaria, que presenta una hebra codificante y una hebra no codificante, con una matriz anterógrada y una matriz inversa, en el que

i) dicha matriz anterógrada comprende una secuencia ácido nucleica que comprende una región de reconocimiento en el extremo 3' que es complementaria al extremo 3' de la hebra no codificante de la secuencia diana y un sitio de unión de enzima de mellado y un sitio de mellado aguas arriba de dicha región de reconocimiento y una región estabilizante aguas arriba de dicho sitio de mellado; y

ii) dicha matriz inversa comprende una secuencia nucleótida que comprende una región de reconocimiento en el extremo 3' que es complementaria al extremo 3' de la hebra codificante de la secuencia diana, un sitio de unión de enzima de mellado y un sitio de mellado aguas arriba de dicha región de reconocimiento, y una región estabilizante aguas arriba de dicho sitio de mellado;

b) proporcionar un primer enzima de mellado que puede practicar mellas en el sitio de mellado de dicha matriz anterógrada, y que no practica mellas en el interior de dicha secuencia diana;

c) proporcionar un segundo enzima de mellado que puede practicar mellas en el sitio de mellado de dicha matriz inversa y que no practica mellas en el interior de dicha secuencia diana; y

d) proporcionar una ADN polimerasa;

bajo condiciones esencialmente isotérmicas, en el que la amplificación se lleva a cabo mediante ciclos múltiples de dicha polimerasa que extiende dichas matrices anterógrada e inversa a lo largo de dicha secuencia diana, produciendo un sitio de mellado bicatenario, y dichos enzimas de mellado que practican mellas en dichos sitios de mellado, o copias amplificadas de dichos sitios, produciendo un producto de amplificación.

Reacción de amplificación de extensión y mellado para la amplificación exponencial de los ácidos nucleicos.

Campo de la invención La invención se refiere, en general, a la amplificación exponencial rápida de cortas secuencias de ADN o ARN a temperatura constante.

Antecedentes El campo del diagnóstico in vitro está desarrollándose rápidamente, pues están aumentando exponencialmente los sistemas necesarios que puedan detectar rápidamente la presencia de especies peligrosas, o que determinen la secuencia genética de una región de interés. La atención diagnóstica molecular habitual se centra en la detección de marcadores biológicos e incluye la detección de pequeñas moléculas, ensayos inmunológicos, y pruebas de ácidos nucleicos. La especificidad construida entre dos cadenas ácido nucleicas sustancialmente complementarias, permite un reconocimiento específico y rápido utilizando secuencias únicas de ADN o ARN, cuya simplicidad convierte al ensayo del ácido nucleico en una perspectiva atractiva. La identificación de agentes víricos amenazantes, de productos alimenticios genéticamente modificados, y de polimorfismos de nucleótidos únicos para la gestión de enfermedades, constituyen sólo algunos ámbitos en los que el avance de estas herramientas diagnósticas moleculares se convierte en extremadamente ventajoso. Para hacer frente a estas crecientes necesidades, se han desarrollado tecnologías de amplificación de ácido nucleico, que se han adecuado a estas necesidades de especificidad y sensibilidad.

Históricamente, la técnica de amplificación más habitual es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , que, en muchos casos se ha convertido en la “regla de oro” para los procedimientos de detección, debido a su especificidad y fiabilidad. Esta técnica necesita un ciclo térmico con objeto de proceder a través de las etapas de desnaturalización del dsADN, hibridación de cortos cebadores oligonucleótidos, y extensión del cebador a lo largo de la matriz mediante una polimerasa termoestable. Aunque muchos nuevos avances en ingeniería genética han acortado con éxito estos tiempos de reacción a 20-30 minutos, es todavía necesaria una capacidad de planteamiento para cumplir con las necesidades de estas unidades termocicladoras.

Para soslayar la necesidad de la ciclación térmica, se han desarrollado varias técnicas de amplificación isotérmica. Debido a esta circunstancia, han emergido tecnologías de amplificación isotérmica tanto para el ADN como para el ARN.

La amplificación mediada por la trascripción (TMA) utiliza una transcriptasa inversa con actividad RNásica, una RNA polimerasa, y cebadores con una secuencia promotora en el extremo 5’. La transcriptasa inversa sintetiza cADN a partir del cebador, degrada el ARN diana, y sintetiza la segunda hebra después de que el cebador inverso se una. Entonces, la ARN polimerasa se une a la región promotora del dsADN y trascribe nuevos transcritos ARN que pueden servir como matrices para una trascripción inversa ulterior. La reacción puede producir una amplificación de un billón de veces en 20-30 minutos. Este sistema no es tan robusto como otras técnicas de amplificación del ADN y no constituye, por tanto, un ensayo de ámbito implantable debido a la presencia de las ARNasas externas de un laboratorio estéril. Esta técnica de amplificación es muy similar a la Replicación Secuencial Auto-Sostenida (3SR) yla Amplificación Basada en la Secuencia Ácido Nucleica (NASBA) , pero varía en los enzimas utilizados.

La Amplificación Isotérmica de Cebador Único (SPIA) también implica polimerasas múltiples y RNasaH. En primer lugar, una transcriptasa inversa extiende un cebador quimérico a lo largo de un ARN diana. La RNasaH degrada el ARN diana y permite que una ADN polimerasa sintetice la segunda hebra del cADN. Entonces, RNasaH degrada una parte del cebador quimérico, para liberar una parte del cADN y abrir un sitio de unión para que el próximo cebador quimérico se una, teniendo lugar entonces, otra vez, el proceso de amplificación a través del ciclo. El sistema lineal de amplificación puede amplificar niveles muy bajos del ARN diana en aproximadamente 3, 5 horas.

El sistema Q-Beta replicasa constituye un procedimiento de amplificación de una sonda. Una región de una sonda, complementaria o sustancialmente complementaria a la diana de elección, se inserta en MDV-1 RNA, una matriz que se presenta de modo natural para la Q-beta replicasa. Q-Beta replica el plásmido MDV-1, de forma que el producto sintetizado es en sí mismo una matriz para la Q-Beta replicasa, dando lugar a una amplificación exponencial de modo que existe replicasa en exceso para la matriz. Debido a que el proceso de replicación de Q-Beta es tan sensible, y puede llevar a cabo la amplificación tanto si la diana está presente o no, son necesarias múltiples etapas de lavado para purgar la muestra de plásmidos de replicación no unidos específicamente. La amplificación exponencial tarda aproximadamente 30 minutos, sin embargo, el tiempo total que incluye todas las etapas de lavado, es aproximadamente de 4 horas.

También se han desarrollado numerosas tecnologías de amplificación isotérmica del ADN. La amplificación en círculos rodantes (RCA) se desarrolló basándose en la replicación natural de plásmidos y virus. Un cebador se propaga a lo largo de una matriz circular, dando lugar a la síntesis de una repetición monocatenaria en tandem. Las etapas de captura, lavado y unión son necesarias para circularizar preferentemente la matriz en presencia de la diana y reducir la amplificación anterior. La amplificación de ramificación (RAM) añade cebadores en cascada para una amplificación geométrica adicional. Esta técnica implica la amplificación de hebras de tamaños no específicos, que son mono o bicatenarias.

La amplificación dependiente de helicasa (HDA) se beneficia de una helicasa termoestable Tte-UvrD para que un dsADN no enrollado pueda crear hebras monocatenarias que están entonces disponibles para la hibridación y la extensión de los cebadores mediante la polimerasa. El procedimiento HDA termoestable no necesita las proteínas accesorias que el HDA no termoestable requiere. La reacción puede llevarse a cabo a una única temperatura, aunque una desnaturalización térmica inicial para unir los cebadores, genera más producto. Se informa de que los tiempos de reacción son superiores a una hora para amplificar productos con una longitud de 70-120 pares de bases.

La amplificación mediada por circuito cerrado (LAMP) constituye un procedimiento de amplificación isotérmico específico y sensible que utiliza una polimerasa termoestable con posibilidades de desplazamiento de la hebra y cuatro o más cebadores. Los cebadores se diseñan para hibridar consecutivamente a lo largo de la diana en sentido anterógrado e inverso. La extensión de los cebadores externos desplaza a los cebadores internos para liberar las hebras únicas. Cada cebador se diseña para que tenga extremos de tipo horquilla, que, una vez desplazados, encajen en una horquilla para facilitar el autocebado y la ulterior extensión de la polimerasa. Los cebadores adicionales en circuito cerrado pueden disminuir el tiempo de amplificación, pero complica la mezcla reactiva. En general, LAMP constituye un procedimiento dificultoso para ser multipléxico, es decir, amplificar más de una secuencia diana en un momento dado, aunque se informa de que es extremadamente específico, debido a los cebadores múltiples que deben hibridar a la diana para el proceso ulterior de amplificación. Aunque la reacción tiene lugar bajo condiciones isotérmicas, es necesaria una etapa térmica inicial de desnaturalización para las dianas bicatenarias. La amplificación tiene lugar en 20 a 50 minutos y produce un patrón de productos de diversas longitudes.

La amplificación de desplazamiento de la hebra (SDA) se desarrolló por Walker et al. en 1992. El procedimiento de amplificación utiliza dos conjuntos de cebadores, una polimerasa que desplaza una hebra, y una endonucleasa de restricción. Los cebadores tipo “tope” sirven para desplazar los cebadores inicialmente propagados para crear una única hebra para el cebador que esté próximo a unirse. Un sitio de restricción se encuentra en la región 5’ del

cebador. Los nucleótidos tiol-modificados se incorporan a los productos sintetizados para inhibir la descomposición de la hebra sintetizada. Esta modificación crea un sitio mellado en el lado cebador de la hebra, que la polimerasa puede extender. Este enfoque necesita una etapa inicial de desnaturalización térmica para dianas bicatenarias. La reacción se procesa entonces a una temperatura inferior a la de fusión de la... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para amplificar una secuencia diana ácido nucleica bicatenaria, que comprende las etapas siguientes:

a) poner en contacto una molécula de ADN diana, que comprende una secuencia diana bicatenaria, que presenta una hebra codificante y una hebra no codificante, con una matriz anterógrada y una matriz inversa, en el que i) dicha matriz anterógrada comprende una secuencia ácido nucleica que comprende una región de reconocimiento en el extremo 3’ que es complementaria al extremo 3’ de la hebra no codificante de la secuencia diana y un sitio de unión de enzima de mellado y un sitio de mellado aguas arriba de dicha región de reconocimiento y una región estabilizante aguas arriba de dicho sitio de mellado; y

ii) dicha matriz inversa comprende una secuencia nucleótida que comprende una región de reconocimiento en el extremo 3’ que es complementaria al extremo 3’ de la hebra codificante de la secuencia diana, un sitio de unión de enzima de mellado y un sitio de mellado aguas arriba de dicha región de reconocimiento, y una región estabilizante aguas arriba de dicho sitio de mellado;

b) proporcionar un primer enzima de mellado que puede practicar mellas en el sitio de mellado de dicha matriz anterógrada, y que no practica mellas en el interior de dicha secuencia diana;

c) proporcionar un segundo enzima de mellado que puede practicar mellas en el sitio de mellado de dicha matriz inversa y que no practica mellas en el interior de dicha secuencia diana; y

d) proporcionar una ADN polimerasa;

bajo condiciones esencialmente isotérmicas, en el que la amplificación se lleva a cabo mediante ciclos múltiples de dicha polimerasa que extiende dichas matrices anterógrada e inversa a lo largo de dicha secuencia diana, produciendo un sitio de mellado bicatenario, y dichos enzimas de mellado que practican mellas en dichos sitios de mellado, o copias amplificadas de dichos sitios, produciendo un producto de amplificación.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los primeros y segundos enzimas de mellado pueden practicar mellas aguas arriba, aguas abajo, o en los sitios de unión de enzima de mellado de dichas matrices anterógrada e inversa, y en el que:

(i) la región de reconocimiento de dicha matriz anterógrada es de 8-12, 8-13 u 8-15 nucleótidos de longitud y la región de reconocimiento de la matriz inversa es de 8-12, 8-13 u 8-15 nucleótidos de longitud; o

(ii) la secuencia diana comprende de 1 a 5 nucleótidos más que la suma de los nucleótidos de dicha región de reconocimiento de la matriz anterógrada y de dicha región de reconocimiento de la matriz inversa.

3. Procedimiento para amplificar una secuencia diana ácido nucleica monocatenaria que comprende las etapas siguientes:

f) poner en contacto un ácido nucleico diana que comprende una secuencia diana monocatenaria con una matriz inversa, en el que dicha matriz inversa comprende una secuencia ácido nucleica que comprende una región de reconocimiento en el extremo 3’ y que es complementaria al extremo 3’ de la secuencia diana, un sitio de unión de enzima de mellado, y un sitio de mellado aguas arriba de dicha región de reconocimiento, y una región estabilizante aguas arriba de dicho sitio de mellado;

g) proporcionar un primer enzima de mellado que puede practicar mellas en el sitio de mellado de dicha matriz inversa, y que no practica mellas en el interior de dicha secuencia diana;

h) proporcionar una ADN polimerasa bajo condiciones en las que dicha polimerasa extiende dicha matriz inversa a lo largo de dicha secuencia diana;

i) poner en contacto dicha matriz inversa extendida con una matriz anterógrada, en el que dicha matriz

anterógrada comprende una región de reconocimiento en el extremo 3’ que es complementaria al extremo 3’

de la matriz inversa extendida, un sitio de unión de enzima de mellado y un sitio de mellado aguas arriba de dicha región de reconocimiento, y una región estabilizante aguas arriba de dicho sitio de mellado;

j) proporcionar un segundo enzima de mellado que puede practicar mellas en el sitio de mellado de dicha matriz anterógrada y que no practica mellas en el interior de dicha secuencia diana o en el interior del complemento de dicha secuencia diana;

en el que la amplificación se realiza bajo condiciones esencialmente isotérmicas, en el que la amplificación se realiza mediante ciclos múltiples de dicha polimerasa que extiende dichas matrices anterógrada e inversa a lo largo de dicha secuencia diana, produciendo sitios de mellado bicatenarios, y dichos enzimas de mellado que practican mellas en dicho sitios de mellado, produciendo un producto de amplificación; en el que además (ii) la región de reconocimiento de la matriz anterógrada es de 8-15 nucleótidos de longitud y la región de reconocimiento de la matriz inversa es de 8-15 nucleótidos de longitud; y/o (iii) la temperatura de la reacción de amplificación es superior a la temperatura inicial de fusión del complejo matriz/secuencia diana.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la región de reconocimiento de la matriz anterógrada es de 812 u 8-13 nucleótidos de longitud y la región de reconocimiento de la matriz inversa es de 8-12 u 8-13 nucleótidos de longitud.

5. Procedimiento según la reivindicación 3 o 4, en el que la secuencia diana comprende de 1 a 5 nucleótidos más que la suma de los nucleótidos de dicha región de reconocimiento de la matriz anterógrada y dicha región de reconocimiento de la matriz inversa.

6. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 5, en el que la temperatura de la reacción de amplificación es superior a la temperatura inicial de fusión del complejo matriz/secuencia diana.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha ADN polimerasa es una polimerasa termófila y/o presenta capacidad para el desplazamiento de la hebra.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha polimerasa se selecciona de entre el grupo constituido por Bst (fragmento grande) , 9ºN, VentR® (exo-) ADN polimerasa, Therminator, y Therminator II.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dichos enzimas de mellado practican mellas aguas abajo del sitio de unión de enzima de mellado.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dichas matrices anterógrada e inversa comprenden unos sitios de unión de enzima de mellado reconocidos por el mismo enzima de mellado y dicho primer y dicho segundo enzimas de mellado son los mismos.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el enzima de mellado se selecciona de entre el grupo de enzimas de mellado representados en la Tabla 3, en el que preferentemente el enzima de mellado se selecciona de entre el grupo que consiste en Nt.Bst.NBI, Nb.BsmI y Nb.BsrDI.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la amplificación se lleva a cabo entre 54ºC y 60ºC.

13. Procedimiento según la reivindicación 2 o 4, en el que por lo menos se obtiene una amplificación de 1E+7 veces de una secuencia diana d.

2. 35 nucleótidos de largo cuando la reacción de amplificación se ejecuta durante 12 minutos.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende además la detección del producto de amplificación.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la región estabilizante presenta un contenido de GC de por lo menos 40%, y/o una longitud de por lo menos 6 nucleótidos.

16. Kit para amplificar una secuencia diana ácido nucleica, que comprende:

a) una ADN polimerasa;

b) una primera matriz para la amplificación de un ácido nucleico, que comprende una región de reconocimiento de 8-15 nucleótidos de longitud en el extremo 3’ que es complementaria al extremo 3’ de una hebra codificante de una secuencia diana; un sitio de unión de enzima de mellado y un sitio de mellado aguas arriba de dicha región de reconocimiento; y una región estabilizante aguas arriba de dicho sitio de mellado;

c) una segunda matriz para la amplificación de ácido nucleico, que comprende una región de reconocimiento de 8-15 nucleótidos de longitud en el extremo 3’ que es complementaria al extremo 3’ del complemento de la hebra codificante de la secuencia diana; un sitio de unión de enzima de mellado, y un sitio de mellado aguas arriba de dicha región de reconocimiento; y una región estabilizante aguas arriba de dicho sitio de mellado; y

d) uno o dos enzimas termoestables de mellado, en el que, o bien un enzima puede practicar mellas en el sitio de mellado de dicha primera y dicha segunda matrices, o un primer enzima puede practicar mellas en el sitio de mellado de dicho primer cebador y un segundo enzima puede practicar mellas en el sitio enzimático de dicho segundo cebador.

17. Kit según la reivindicación 16, en el que la región de reconocimiento de la primera matriz presenta una longitud de 8-12 u 8-13 nucleótidos y la región de reconocimiento de la segunda matriz presenta una longitud de 8-12 u 8-13 nucleótidos.

18. Kit según las reivindicaciones 16 a 17, en el que dichas polimerasa y enzimas de mellado se encuentran en un primer recipiente, y dichas matrices se encuentran en un segundo recipiente.

19. Kit según las reivindicaciones 16 a 18, que comprende además unas instrucciones para seguir el procedimiento de amplificación.

20. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, que comprende además un componente detector seleccionado de entre el grupo que consiste en un colorante fluorescente, partículas de oro coloidal, partículas de látex, una baliza molecular, y perlas de poliestireno.

21. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que por lo menos una de dichas matrices comprende un espaciador, un grupo de bloqueo, o un nucleótido modificado.

22. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, en el que la región estabilizante presenta un contenido de GC de por lo menos 40% y/o una longitud de por lo menos 6 nucleótidos.

23. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, que comprende una ADN polimerasa tal como se define en la reivindicación 7 o la reivindicación 8, y/o un enzima de mellado tal como se define en la reivindicación 11.

24. Procedimiento para proporcionar unas primera y segunda matrices para amplificar un ácido nucleico diana, comprendiendo dicho procedimiento el diseño y la producción de las matrices, diseñándose ambas matrices de manera que exista una región de reconocimiento de 8-12 u 8-13 nucleótidos de longitud en el extremo 3’; un sitio de unión de enzima de mellado y un sitio de mellado aguas arriba de dicha región de reconocimiento; y una región estabilizante aguas arriba de dicho sitio de mellado; en el que la región de reconocimiento de la matriz anterógrada es complementaria al extremo 3’de una hebra codificante de la secuencia diana y la región de reconocimiento de la matriz inversa es complementaria al extremo 3’ del complemento de la hebra codificante de la secuencia diana.

25. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dichas matrices están diseñadas de manera que:

(i) el sitio de mellado se encuentra aguas abajo del sitio de unión de enzima de mellado;

(ii) los sitios de unión de enzima de mellado son reconocidos por el mismo enzima de mellado;

(iii) los sitios de unión de enzima de mellado se unen por un enzima de mellado seleccionado de entre el grupo de enzimas de mellado representados en la Tabla 3, en el que preferentemente el enzima de mellado se selecciona de entre el grupo que consiste en Nt.Bst.NBI, Nb.BsmI y Nb.BsrDI; y/o (iv) la región estabilizante presenta un contenido de GC de por lo menos 40% y/o una longitud de por lo menos 6 nucleótidos.