Purificación de la eritropoyetina.

Método in vitro de purificación de eritropoyetina, que comprende:

a) proporcionar una solución que contiene: i) eritropoyetina, e ii) iones calcio a una primera concentración, que comprende TRIS-HCl 20 mM, CaCl2 5 mM, pH 6,9 ± 0,2,

b) proporcionar una columna de cromatografía que contiene una fase estacionaria que contiene hidroxiapatito cerámico, c) aplicar una solución que contiene iones calcio a una segunda concentración en la columna de b) que comprende TRIS-HCl 20 mM, CaCl2 5 mM, NaCl 0,25 M, 2-propanol al 9% (v/v) con un pH de 6,9 ± 0,2,

d) aplicar la solución de a) en la columna obtenida en c),

e) aplicar una solución que contiene iones calcio a una tercera concentración en la columna obtenida en d) que comprende TRIS-HCl 20 mM, NaCl 0,25 M, 2-propanol al 9% (v/v) con un pH de 6,9 ± 0,2, y

f) recuperar la eritropoyetina purificada mediante la aplicación de una solución que contiene iones calcio a una cuarta concentración en la columna obtenida en e) que comprende TRIS-HCl 10 mM, pH 6,9 ± 0,2,

en el que dichas primera y segunda concentraciones de ión calcio son iguales y dichas tercera y cuarta concentraciones de ión calcio son iguales, inferiores a dichas primera y segunda concentraciones de ión calcio, en el que dichas tercera y cuarta concentraciones de ión calcio son de 0,1 mM o inferiores.

Purificación de la eritropoyetina.

En la presente memoria se da a conocer un método para purificar eritropoyetina (EPO) utilizando cromatografía en hidroxiapatito. Además, se describe un método para el empobrecimiento en proteínas de la célula huésped, así como a un método para modificar la distribución de isoformas de una composición de EPO.

Antecedentes de la invención La eritropoyetina (EPO) es una glucoproteína humana que estimula la producción de los glóbulos rojos. Su acción y aplicación terapéutica se describen en detalle en, por ejemplo, las patentes EP nº 0 148 605, nº 0 205 564, nº 0 209 539 y nº 0 411 678, así como en Huang S.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2708-2712, 1984; Lai P.H. et al., J. Biol. Chem. 261:3116-3121, 1986, y Sasaki H. et al., J. Biol. Chem. 262:12059-12076, 1987.

La EPO se encuentran presente sólo a concentraciones muy bajas en el plasma sanguíneo de las personas sanas. Es conocido el aislamiento de la EPO humana a partir de la orina de los pacientes con anemia aplásica (Miyake T. et al., J. Biol. Chem. 252:5558-5564, 1977) . Se ha descrito un método en siete etapas que comprende cromatografía de intercambio iónico, precipitación con etanol, filtración en gel y cromatografía de adsorción. Las patentes EP nº 0 148 605 y nº 0 205 564 dan a conocer la producción de EPO humana recombinante en células CHO. Un método para purificar EPO producido recombinantemente ha sido descrito en Nobuo I. et al., J. Biochem. 107:352-359, 1990.

Se conocen métodos adicionales para producir y purificar eritropoyetina y describen en, entre otros, las patentes EP nº 0 148 605, nº 0 205 564, nº 0 255 231, nº 0 830 376, nº 0 267 678, nº 0 228 452, nº 1 127 063, nº 0 209 539, nº 0 358 463, nº 1 010 758, nº 0 820 468, nº 0 984 062, nº 0 640 619, nº 0 428 267, nº 1 037 921 y en Lai P.H. et al., J. Biol. Chem. 261:3116-3121, 1986; Broudy V.C. et al., Arch. Biochem. Biophys. 265:329-336, 1988; Zou Z. et al., Journal of Chrom. 16:263-264, 1998; Inoue N. et al., Biol. Pharm. Bull. 17:180-184, 1994; Qian R.L. et al., Blood 68 (1) :258-262, 1986; Kr y stal G. et al., Blood 67 (1) :71-79, 1986; Lange R.D. et al., Blood Cells 10 (2-3) :305-314, 1984; Sasaki R. et al., Methods Enzymol. 147:328-340, 1987; Ben Ghanem A. et al., Prep. Biochem. 24:127-142, 1994; Cifuentes A. et al., J. Chrom. A 830:453-463, 1999; y Gokana A. et al., J. Chromat. A 791:109-118, 1997.

La patente EP nº 1 394 179 da a conocer un método para producir eritropoyetina libre de proteínas animales. La producción de eritropoyetina mediante la activación de un gen endógeno con promotores víricos es la materia objeto de la patente EP nº 0 986 644. Se da a conocer un método para producir glucoproteínas recombinantes y en particular eritropoyetina en la patente EP nº 1 428 878. Se da a conocer un método para producir un perfil deseado de glucoisoformas de eritropoyetina en la patente EP nº 1 492 878.

La patente EP nº 1 428 878 da a conocer un procedimiento para la producción y purificación de eritropoyetina. Se da a conocer un método para purificar eritropoyetina en el documento WO nº 2005/121173. En el documento WO nº 99/28346 se da a conocer una eritropoyetina de elevada actividad específica. Se da a conocer una composición de eritropoyetina en el documento US nº 2004/147431. En el documento WO nº 03/080852 se da a conocer un procedimiento para la preparación de un perfil deseado de glucoisobformas de eritropoyetina.

Descripción resumida de la invención La producción y purificación de eritropoyetina recombinante requiere varias etapas, en particular etapas de cromatografía.

Un primer aspecto de la invención es un método para producir eritropoyetina, que comprende por lo menos una etapa de cromatografía con una fase estacionaria que contiene hidroxiapatito, que comprende las etapas de:

i) poner en contacto una solución que contiene eritropoyetina que contiene iones calcio a una concentración de 5 mM que comprende TRIS-HCl 20 mM, pH 6, 9 ± 0, 2, con una fase estacionaria que contiene hidroxiapatito cerámico que ha sido equilibrado con una solución que contiene iones calcio a la misma concentración de 5 mM que comprende TRIS-HCl 20 mM, NaCl 0, 25 M, 2-propanol al 9% (v/v) , pH 6, 9 ± 0, 2, ii) pasar una solución que contiene iones calcio a una concentración inferior a 0, 1 mM sobre la fase estacionaria que contiene hidroxiapatito cerámico que comprende TRIS-HCl 20 mM, NaCl 0, 25 M, 2-propanol al 9% (v/v) , pH 6, 9 ± 0, 2, y iii) pasar una solución que contiene iones calcio a una concentración inferior a 0, 1 mM que comprende TRIS-HCl 10 mM, pH 6, 9 ± 0, 2, sobre la fase estacionaria que contiene hidroxiapatito cerámico, para producir de esta manera eritropoyetina.

En una realización, la eritropoyetina producida se empobrece en las especies des-O-EPO y des-N-EPO en comparación con la solución que contiene eritropoyetina en i) . En una realización adicional, el método comprende por lo menos una etapa adicional de cromatografía además de la etapa de cromatografía con una fase estacionaria que contiene hidroxiapatito. En una realización adicional, cada una de todas las etapas de cromatografía se basa en diferentes principios cromatográficos, en los que cada principio cromatográfico se utiliza únicamente una vez en el método. En una realización adicional, el principio o principios cromatográficos se seleccionan de entre cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de fase inversa, cromatografía de permeación en gel, cromatografía de intercambio catiónico y/o cromatografía de intercambio aniónico. En una realización adicional, la secuencia de etapas cromatográficas es: cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía en una fase estacionaria que contiene hidroxiapatito, cromatografía de fase opcionalmente inversa y cromatografía de intercambio aniónico. En una realización, el método según la invención comprende etapas intermedias opcionales, tales como la precipitación con sales, la concentración, la diafiltración, la ultrafiltración, la diálisis, y/o la precipitación con etanol además de las etapas de cromatografía.

En otra realización, la solución utilizada en la cromatografía en la etapa ii) y/o iii) contiene fosfato sódico o potásico 5 mM.

Todavía un aspecto adicional de la presente invención es un método para producir eritropoyetina recombinante, que comprende cultivar células huésped que contienen un ácido nucleico codificante de eritropoyetina, en un medio adecuado bajo condiciones adecuadas para producir eritropoyetina, y aislar la eritropoyetina a partir del medio de cultivo o de las células. Las células se cultivan en suspensión en una realización. En una realización adicional, las células se cultivan en un fermentador y en particular en un fermentador con un volumen de entre 10 y 50.000 l.

El aislamiento de la eritropoyetina a partir del medio de cultivo comprende las etapas siguientes:

(a) aplicar el sobrenadante de cultivo celular a un material de cromatografía de afinidad y recuperar/recolectar las fracciones que contienen eritropoyetina,

(b) opcionalmente aplicar las fracciones de (a) a un material de cromatografía de interacción hidrofóbica y recuperar/recolectar las fracciones que contienen eritropoyetina,

(c) aplicar las fracciones de (a) o (b) a una fase estacionaria que contiene hidroxiapatito y recuperar/recolectar las fracciones que contienen eritropoyetina utilizando un método según la presente invención, y

(d) concentrar y/o pasar las fracciones de (c) sobre un material de HPLC de fase inversa.

La etapa (a) del método de purificación comprende pasar el sobrenadante celular, que opcionalmente puede pretratarse, sobre un material de cromatografía de afinidad. En una realización, el material de cromatografía de afinidad es uno al que se ha acoplado un pigmento azul. Un ejemplo es la sefarosa azul. En una realización, tras la elución del material de cromatografía de afinidad, el eluido que contiene eritropoyetina se pasa sobre un material de cromatografía de interacción hidrofóbica en el caso de que se utilice un medio de cultivo con un contenido de suero ≥2% (v/v) para la fermentación/producción. En una realización, el material de cromatografía de interacción hidrofóbica es butil-sefarosa. El eluido de la etapa (a) o, en caso de utilizarse, de la etapa b) , se pasa sobre una fase estacionaria que contiene hidroxiapatito en la etapa (c) y se aísla el eluido que contiene eritropoyetina. En una realización, la concentración se lleva a cabo mediante cromatografía de exclusión, por ejemplo filtración a través de una membrana.... [Seguir leyendo]

1. Método in vitro de purificación de eritropoyetina, que comprende:

a) proporcionar una solución que contiene: i) eritropoyetina, e ii) iones calcio a una primera concentración, que comprende TRIS-HCl 20 mM, CaCl2 5 mM, pH 6, 9 ± 0, 2, b) proporcionar una columna de cromatografía que contiene una fase estacionaria que contiene hidroxiapatito cerámico, c) aplicar una solución que contiene iones calcio a una segunda concentración en la columna de b) que comprende TRIS-HCl 20 mM, CaCl2 5 mM, NaCl 0, 25 M, 2-propanol al 9% (v/v) con un pH de 6, 9 ± 0, 2, d) aplicar la solución de a) en la columna obtenida en c) , e) aplicar una solución que contiene iones calcio a una tercera concentración en la columna obtenida en d) que comprende TRIS-HCl 20 mM, NaCl 0, 25 M, 2-propanol al 9% (v/v) con un pH de 6, 9 ± 0, 2, y f) recuperar la eritropoyetina purificada mediante la aplicación de una solución que contiene iones calcio a una cuarta concentración en la columna obtenida en e) que comprende TRIS-HCl 10 mM, pH 6, 9 ± 0, 2, en el que dichas primera y segunda concentraciones de ión calcio son iguales y dichas tercera y cuarta concentraciones de ión calcio son iguales, inferiores a dichas primera y segunda concentraciones de ión calcio, en el que dichas tercera y cuarta concentraciones de ión calcio son de 0, 1 mM o inferiores.

2. Método de producción de eritropoyetina mediante la utilización de una secuencia de etapas cromatográficas tal como la siguiente:

i) cromatografía de afinidad, ii) cromatografía de interacción hidrofóbica, iii) cromatografía en una fase estacionaria que contiene hidroxiapatito cerámico, en la que la cromatografía en una fase estacionaria que contiene hidroxiapatito se lleva a cabo según la reivindicación 1.

3. Método de producción de eritropoyetina, que comprende cultivar células que contienen un ácido nucleico codificante de EPO y aislar la eritropoyetina a partir de las células o del medio de cultivo, caracterizado porque el aislamiento de eritropoyetina comprende las etapas siguientes:

i) aplicar el sobrenadante celular en un material de cromatografía de afinidad y recuperar/recolectar las fracciones que contienen eritropoyetina, ii) opcionalmente aplicar las fracciones que contienen eritropoyetina obtenidas de i) en un material de cromatografía de interacción hidrofóbica y recuperar/recolectar las fracciones que contienen eritropoyetina, iii) aplicar las fracciones que contienen eritropoyetina de i) o ii) en una fase estacionaria que contiene hidroxiapatito cerámico y recuperar/recolectar las fracciones que contienen eritropoyetina utilizando un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

4. Método de producción de eritropoyetina mono-PEGilada, que comprende las etapas siguientes: i) purificar la eritropoyetina con un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, ii) PEGilar la eritropoyetina utilizando un PEG activado con un peso molecular de entre 20 kDa y 40 kDa, iii) purificar la eritropoyetina PEGilada obtenida en la etapa ii) con dos etapas sucesivas de cromatografía de intercambio catiónico utilizando la misma fase estacionaria, iv) recuperar y producir de esta manera eritropoyetina mono-PEGilada a partir de la segunda fase estacionaria.