Proteínas de fusión no citotóxicas que comprenden muteínas de EGF.

Un polipéptido, que comprende:

a. una proteasa no citotóxica que es capaz de escindir una proteína SNARE;

b. un péptido de translocación que es capaz de translocar dicha proteasa no citotóxica de dentro de un endosoma deuna célula mamífera, a través de la membrana endosomal de la misma y en el citosol de la célula mamífera; y

c. una muteína del factor del crecimiento epidérmico (EGF), en el que

dicha muteína del EGF comprende una secuencia aminoacídica que tiene al menos el 95% de identidad desecuencia con respecto a la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 11 y en el que dicha muteína del EGF retiene laafinidad de unión de SEQ ID NO: 11 para unirse a un receptor del EGF.

Proteínas de fusión no citotóxicas que comprenden muteínas de EGF.

La presente invención se refiere a proteínas de fusión no citotóxicas, y al uso de las mismas con productos terapéuticos para suprimir afecciones tales como hipersecreción de mucus, inflamación, trastornos neuroendocrinos y tumores neuroendocrinos.

Las proteasas no citotóxicas son un grupo discreto de proteasas, que actúan sobre las células dianas incapacitando la función celular. De manera importante, las proteasas no citotóxicas no destruyen las células diana sobre las que actúan. Algunos de los mejores ejemplos conocidos de las proteasas no citotóxicas incluyen neurotoxinas clostridiales y proteasas de IgA.

Las proteasas no citotóxicas actúan escindiendo de forma proteolítica las proteínas de transporte intracelular conocidas como proteínas SNARE (por ejemplo, SNAP-25, VAMP o Sintaxina) - véase Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4ª edición) John Wiley & Sons, Inc. El acrónimo SNARE deriva del término receptor de unión a la NSF soluble (Soluble NSF Attachment Receptor) , donde NSF significa factor sensible a la N-etil-maleimida (N-ethyl-maleimide-Sensitive Factor) . Las proteínas SNARE son esenciales para la formación de vesículas intracelulares y, por lo tanto, para la secreción de moléculas a través del transporte de vesículas de una célula. Por

consiguiente, una vez administrada una célula diana deseada, la proteasa no citotóxica es capaz de inhibir la secreción celular de la célula diana.

En vista de la naturaleza omnipresente de las proteínas SNARE, las proteasas no citotóxicas se han empleado con éxito en una gran diversidad de terapias, tales como: el tratamiento del dolor (véase el documento WO96/33274) ; el tratamiento de afecciones relacionadas con la hipersecreción de mucus, tales como EPOC, asma (véase el documento WO00/10598) ; el tratamiento de afecciones no neuronales, tales como afecciones endocrinas, afecciones exocrinas, afecciones inmunológicas, afecciones cardiovasculares, afecciones óseas (véase el documento WO01/21213) ; el tratamiento de trastornos neurológicos, tales como la enfermedad de Parkinson (véanse los documentos US 6.620.415, US 6.306.403) ; el tratamiento de trastornos neuropsiquiátricos (véanse los documentos US2004/0180061, US2003/0211121) ; el tratamiento de trastornos endocrinos (véase el documento US 6.827.931) ; el tratamiento de trastornos tiroideos (véase el documento US 6.740.321) ; el tratamiento de la diabetes (véanse los documentos US 6.337.075, US 6.416.765) ; y el tratamiento de trastornos pancreáticos (véanse los documentos US 6.261.572, US 6.143.306) .

El documento US2008/032928 describe el tratamiento de la hipersecreción de mucus, composiciones para la misma y la fabricación de las composiciones. Se hace referencia particular al tratamiento de bronquitis crónica en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) , asma y otras afecciones clínicas que implican EPOC.

Foster K A, y col. (2006) "Re-engineering the target specificity of Clostridial neurotoxins - a route to novel

therapeutics" describen la producción de una proteína de fusión completamente recombinante de un gen recombinante que codifica tanto el dominio LHN de una neurotoxina clostridial y un dominio diana específico, junto con la capacidad de dichas proteínas de fusión recombinantes de inhibir la secreción de células diana no neuronales.

El documento US 2008/038274 describe el tratamiento de una enfermedad mediante la inhibición de procesos secretores celulares, agentes y composiciones para la misma, y la fabricación de estos agentes y composiciones. Se hace referencia particular al tratamiento de una enfermedad dependiente de la actividad exocitótica de células endocrinas, células exocrinas, células inflamatorias, células del sistema inmune, células del sistema cardiovascular y células óseas.

Generalmente, se tolera bien la administración de una proteasa no citotóxica. Sin embargo, la administración en algunos casos puede ser difícil debido a que se requieren dosis mayores para conseguir un efecto beneficioso. Las dosis más grandes pueden aumentar la probabilidad de respuestas antigénicas no deseadas. De forma análoga, las dosis mayores están asociadas a un aumento del coste de fabricación.

En común con otras sustancias medicamentosas, existe un intervalo de dosificación terapéutica que identifica los límites inferiores y superiores de una terapia segura y eficaz. A menudo, el límite superior se determina por la importancia creciente de los efectos inespecíficos que conducen a efectos secundarios indeseables (por ejemplo potencialmente dañinos) del tratamiento farmacológico. En el caso de proteasas no citotóxicas, esto podría conducir a la parálisis de la secreción celular en las células inespecíficas, lo que, a su vez, puede ser fatal.

El uso de moléculas de proteasa no citotóxica en tratamientos terapéuticos de seres humanos y otros mamíferos está atrayendo cada vez mayor interés. A este respecto, un área de enfoque de interés radica en el uso de proteasas no citotóxicas re-dirigidas al factor de crecimiento epidérmico (EGF) . Se ha demostrado que estos productos terapéuticos son útiles en la reducción de la secreción de mucus (véase el documento WO00/10598) , y la inflamación (véase el documento US11/806.648) . Los presentes inventores también han descubierto que las proteasas no citotóxicas re-dirigidas a EGF son útiles en la supresión de trastornos neuroendocrinos y tumores neuroendocrinos.

Sin embargo, un problema asociado a la aplicación terapéutica de las proteasas no citotóxicas basadas en EGF es que la eficacia puede requerir el uso de niveles de dosificación relativamente altos. Como se ha mencionado anteriormente, esto es deseable para esto no es deseable debido al aumento de los costes de fabricación y/o problemas potenciales de inmunogenicidad.

Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de desarrollar medios para reducir tamaños de dosificación y/o para reducir respuestas antigénicas no deseables, mientras que se mantiene la potencia de la proteasa no citotóxica. Esta necesidad se ve exacerbada por el uso creciente de las proteasas no citotóxicas, que tiene en cuenta una necesidad creciente por parte de la industria farmacéutica de desarrollar moléculas terapéuticas alternativas y/o mejoradas.

La presente invención aborda la necesidad o necesidades anteriores, y resuelve uno o más de los problemas que se han mencionado anteriormente. En más detalle, la presente invención proporciona proteasas no citotóxicas re-dirigidas a EGF alternativas y/o mejoradas, que son útiles para diversas aplicaciones clínicas y

terapéuticas, en particular para el tratamiento de la inflamación, los trastornos relacionados con la secreción de mucus, tales como asma y EPOC, así como trastornos neuroendocrinos y tumores neuroendocrinos.

En más detalle, un primer aspecto de la presente invención proporciona un polipéptido, como se define en las reivindicaciones.

Sin desear quedar ligado a teoría alguna, los presentes inventores creen que el EGF se une a su receptor natural (es decir, el receptor del EGF; también conocido como ErbB1 a través de una reacción de unión, que implica dos interfaces de unión distintas presentes en la molécula de EGF, concretamente una primera interfaz de unión (es decir, Interfaz de Unión 1) proporcionada por la secuencia de residuos aminoacídicos en las posiciones 31-40 de SEQ ID NO: 1, y una segunda interfaz de unión (es decir, Interfaz de Unión 2) proporcionada por la secuencia de residuos aminoacídicos en las posiciones 41-45 de SEQ ID NO: 1. Se cree que estas dos Interfaces de Unión se unen a cada lado de una hendidura, que está presente en el receptor del EGF, y en el que después se inserta una pequeña porción (denominada como Extremo de Avance) de la molécula del EGF. El Extremo de Avance se proporciona por la secuencia de residuos aminoacídicos en las posiciones 48-51 de SEQ ID NO: 1 e incluye una secuencia de soporte estructural proporcionada por las posiciones 15-17 de SEQ ID NO: 1. Esta disposición de unión se ilustra en la figura 2, en la que la hendidura con forma de U del receptor se sitúa en la parte superior y a la izquierda de la figura 2 y la cara "abierta" de los puntos de hendido hacia el centro de la figura 2.

En más detalle, los presentes inventores creen que los residuos aminoacídicos "voluminosos" presentes en 45 el Extremo de Avance (posiciones 15-17 y 48-51 de SEQ ID NO: 1) del EGF reducen la capacidad de activación del receptor del EGF de las moléculas de fusión no citotóxicas basadas en EGF. Por lo tanto, reduciendo... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido, que comprende:

a. una proteasa no citotóxica que es capaz de escindir una proteína SNARE;

b. un péptido de translocación que es capaz de translocar dicha proteasa no citotóxica de dentro de un endosoma de una célula mamífera, a través de la membrana endosomal de la misma y en el citosol de la célula mamífera; y

c. una muteína del factor del crecimiento epidérmico (EGF) , en el que dicha muteína del EGF comprende una secuencia aminoacídica que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 11 y en el que dicha muteína del EGF retiene la afinidad de unión de SEQ ID NO: 11 para unirse a un receptor del EGF.

2. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende una secuencia aminoacídica que tiene al menos el 80% o al menos el 90% o al menos el 95% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia aminoacídica seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 37, 64, 66 y 68.

3. Un polipéptido de acuerdo cualquier reivindicación anterior, en el que la proteasa no citotóxica comprende una proteasa de la neurotoxina clostridial o una proteasa de IgA neisseriana.

4. Un polipéptido de acuerdo cualquier reivindicación anterior, en el que el péptido de translocación comprende un dominio de translocación de la neurotoxina clostridial. 25

5. Un polipéptido de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el polipéptido está presente como un polipéptido bicatenario, en el que la proteasa no citotóxica está unida al péptido de translocación por un enlace disulfuro.

6. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquier reivindicación anterior.

7. Un procedimiento para preparar un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5,

que comprende expresar un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 en una célula huésped, 35 preferiblemente en una célula huésped de E. coli.

8. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para su uso en la supresión de una inflamación.

9. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para su uso en la supresión de la hipersecreción de mucus y/o afecciones o enfermedades relacionadas con la hipersecreción de mucus en un paciente.

10. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para su uso en la supresión de 45 una neoplasia endocrina y/o trastornos neuroendocrinos, tales como enfermedad de Cushing y acromegalia.

11. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para su uso en la supresión de tumores neuroendocrinos, y/o para su uso en la supresión de cáncer colorectal, cáncer de próstata, cáncer de mama, o cáncer de pulmón.