Proteínas biespecíficas de unión a antígeno.

Proteína biespecífica de unión a antígeno, que comprende:

a) dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas de un anticuerpo,

que se unen específicamente a un primerantígeno y que comprende dos fragmentos Fab,

b) dos fragmentos Fab adicionales de un anticuerpo que se une específicamente a un segundo antígeno, endonde dichos fragmentos Fab adicionales se fusionan, ambos mediante un péptido conector, con las cadenaspesadas en a),

en donde, en los fragmentos Fab se llevan a cabo las modificaciones siguientes:

i) en ambos fragmentos Fab de a), o en ambos fragmentos Fab de b), los dominios variables VL y VH sesustituyen uno por otro, y/o

los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro,

ii) en ambos fragmentos Fab en a),

los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, ylos dominios constantes CL y CH1 se sustituyen mutuamente, y

en ambos fragmentos Fab en b),

los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, olos dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro,iii) en ambos fragmentos Fab en a)

los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, olos dominios constantes CL y CH1 se sustituyen mutuamente, yen ambos fragmentos Fab en b),

los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y

los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro,iv) en ambos fragmentos Fab en a),

los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, yen ambos fragmentos Fab en b),

los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen mutuamente, ov) en ambos fragmentos Fab en a),

los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen mutuamente, yen ambos fragmentos Fab en b),

los dominios variables VL y VH se sustituyen mutuamente.

Proteínas biespecíficas de unión a antígeno La presente invención se refiere a proteínas biespecíficas de unión a antígeno, a métodos para la producción de las mismas, a composiciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos y a usos de los mismos.

Antecedentes de la invención Las proteínas manipuladas, tales como los anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos capaces de unirse a dos o más antígenos, son conocidas de la técnica. Estas proteínas de unión multiespecíficas pueden generarse mediante fusión celular, conjugación química o técnicas de ADN recombinante.

Recientemente se ha desarrollado una amplia diversidad de formatos de anticuerpo multiespecífico recombinante, por ejemplo anticuerpos biespecíficos tetravalentes mediante fusión de, por ejemplo, un formato de anticuerpo IgG y dominios de cadena sencilla (ver, por ejemplo, Coloma M.J. et al., Nature Biotech. 15:159-163, 1997; documento WO nº 2001/077342, y Morrison S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234.

Además, se han desarrollado otros nuevos formatos en los que la estructura del núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) ya no se conserva, tales como diacuerpos, triacuerpos o tetracuerpos, minicuerpos, varios formatos de cadena sencilla (scFv, Bis-scFv) , que son capaces de unirse a dos o más antígenos (Holliger P. et al., Nature Biotech. 23:1126-1136, 2005; Fischer N. y Léger O., Pathobiology 74:3-14, 2007; Shen J. et al., J. Immunol. Methods 318:65-74, 2007; Wu C. et al., Nature Biotech. 25:1290-1297, 2007) .

La totalidad de dichos formatos utiliza conectores, para fusionar el núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) a una proteína adicional de unión (por ejemplo scFv) o para fusionar, por ejemplo, dos fragmentos Fab o scFv (Fischer N. y Léger O., Pathobiology 74:3-14, 2007) . Aunque resulta evidente que los conectores presentan ventajas para la manipulación de los anticuerpos biespecíficos, también pueden provocar problemas en contextos terapéuticos. En efecto, estos péptidos foráneos podrían inducir una respuesta inmunológica contra el línker mismo o contra la unión entre la proteína y el línker. Además, la naturaleza flexible de estos péptidos provoca que presenten una mayor tendencia al corte proteolítico, potencialmente conduciendo a una pobre estabilidad del anticuerpo, a agregación y a una inmunogenicidad incrementada. Además, puede desearse retener funciones efectoras, tales como, por ejemplo, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) , que se encuentran mediadas por la parte Fc mediante el mantenimiento de un elevado grado de similitud a anticuerpos naturales.

De esta manera, idealmente el objetivo debe ser el desarrollo de anticuerpos biespecíficos que sean muy similares en la estructura general a los anticuerpos naturales (por ejemplo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) , con diferencias mínimas respecto a las secuencias humanas.

En un enfoque, se han producido anticuerpos biespecíficos que son muy similares a anticuerpos naturales utilizando la tecnología del cuadroma (ver Milstein C. y Cuello A.C., Nature 305:537-540, 1983) basándose en la fusión somática de dos líneas celulares de hibridoma diferentes que expresan anticuerpos monoclonales murinos con las especificidades deseadas del anticuerpo biespecífico. Debido al apareamiento aleatorio de las cadenas pesada y ligera de dos anticuerpos diferentes dentro de la línea celular de hibridoma (o cuadroma) híbrido resultante, se generan hasta diez especies diferentes de anticuerpo de entre las que únicamente una es el anticuerpo biespecífico funcional deseado. Debido a la presencia de productos secundarios mal apareados, y rendimientos de producción significativamente reducidos, resultan necesarios procedimientos de purificación sofisticados (ver, por ejemplo, Morrison S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234) . En general, se mantiene el mismo problema de productos secundarios mal apareados en el caso de que se utilicen técnicas de expresión recombinante.

Un enfoque para evitar el problema de los productos secundarios mal apareados, que se conoce como “botón en ojal”, pretende forzar el apareamiento de dos cadenas pesadas de anticuerpos diferentes mediante la introducción de mutaciones en los dominios CH3 para modificar la interfaz de contacto. En una cadena se sustituyen aminoácidos voluminosos por aminoácidos con cadenas laterales cortas, para crear un “ojal”. A la inversa, se introducen aminoácidos con cadenas laterales grandes en el otro dominio CH3, para crear un “botón”. Mediante la coexpresión de estas dos cadenas pesadas (y dos cadenas ligeras idénticas, que deben ser las apropiadas para ambas cadenas pesadas) , se han observado altos rendimientos de formación de heterodímeros (“botón-ojal”) frente a la formación de homodímeros (“ojal-ojal” o “botón-botón”) (Ridgway J.B., Protein Eng. 9:617-621, 1996, y documento WO nº 96/027011) . El porcentaje de heterodímeros podría incrementarse adicionalmente mediante el remodelaje de las superficies de interacción de los dominios CH3 utilizando un enfoque de expresión fágica y la introducción de un puente disulfuro para estabilizar los heterodímeros (Merchant A.M. et al., Nature Biotech. 16:677681, 1998; Atwell S. et al., J. Mol. Biol. 270:26-35, 1997) . Se describen nuevos enfoques para la tecnología de

botón-en-ojal en, por ejemplo, el documento EP nº 1870459A1. Aunque este formato aparentemente resulta muy atractivo, en la actualidad no se dispone de datos que describan la progresión hacia el uso clínico. Una importante limitación de esta estrategia es que las cadenas ligeras de los dos anticuerpos parentales deben ser idénticas para evitar el apareamiento incorrecto y la formación de moléculas inactivas. De esta manera, esta técnica no resulta apropiada para el desarrollo sencillo de anticuerpos biespecíficos recombinantes contra dos antígenos partiendo de dos anticuerpos contra el primer y segundo antígenos, debido a que las cadenas pesadas de estos anticuerpos y/o las cadenas ligeras idénticas deben optimizarse.

Otro modo de evitar el problema de la aparición de productos secundarios incorrectamente apareados durante la preparación de anticuerpos biespecíficos es la utilización de heterodímeros en lugar de homodímeros, mediante la utilización de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y al que se ha fusionado, en los extremos N-terminales de sus cadenas pesadas, dos fragmentos Fab fusionados que se unen específicamente a un segundo antígeno, tal como se describe en, por ejemplo, el documento WO nº 2001/077342. Una importante desventaja de esta estrategia es la formación de productos secundarios inactivos no deseados por el apareamiento incorrecto de las cadenas ligeras del anticuerpo de longitud completa con los dominios CH1-VH de los fragmentos Fab y por el apareamiento incorrecto de las cadenas ligeras del fragmento Fab con los dominios CH1-VH del anticuerpo de longitud completa.

El documento WO nº 2006/093794 se refiere a composiciones de unión a proteína heterodimérica. El documento WO nº 99/37791 describe derivados de anticuerpos con múltiples fines. Morrison S.L. et al., J. Immunolog. 160:28022808, 1998, se refieren a la influencia del intercambio de dominios de la región variable sobre las propiedades funcionales de la IgG.

Descripción resumida de la invención La invención comprende una proteína biespecífica de unión a antígeno, que comprende:

a) dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas de un anticuerpo, que se unen específicamente a un primer antígeno y que comprenden dos fragmentos Fab, b) dos fragmentos Fab adicionales de un anticuerpo, que se unen específicamente a un segundo antígeno, en donde dichos fragmentos Fab adicionales se fusionan, ambos mediante un péptido conector, a los extremos Cterminales o N-terminales de las cadenas pesadas o de las cadenas ligeras en a) , y en donde, en los fragmentos Fab se llevan a cabo las modificaciones siguientes:

i) en ambos fragmentos Fab de a) , o en ambos fragmentos Fab de b) , los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y/o los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro,

ii) en ambos fragmentos Fab de a) los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro, y en ambos fragmentos Fab de b) los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, o los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro iii) en ambos fragmentos Fab de a) los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, olos dominios constantes CL y CH1 se... [Seguir leyendo]

1. Proteína biespecífica de unión a antígeno, que comprende:

a) dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas de un anticuerpo, que se unen específicamente a un primer antígeno y que comprende dos fragmentos Fab,

b) dos fragmentos Fab adicionales de un anticuerpo que se une específicamente a un segundo antígeno, en donde dichos fragmentos Fab adicionales se fusionan, ambos mediante un péptido conector, con las cadenas 10 pesadas en a) , en donde, en los fragmentos Fab se llevan a cabo las modificaciones siguientes:

i) en ambos fragmentos Fab de a) , o en ambos fragmentos Fab de b) , los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y/o 15 los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro,

ii) en ambos fragmentos Fab en a) , los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen mutuamente, y

en ambos fragmentos Fab en b) , los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, o los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro,

iii) en ambos fragmentos Fab en a)

los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, o los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen mutuamente, y en ambos fragmentos Fab en b) , los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro,

iv) en ambos fragmentos Fab en a) , los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y en ambos fragmentos Fab en b) , los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen mutuamente, o

v) en ambos fragmentos Fab en a) , los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen mutuamente, y en ambos fragmentos Fab en b) , los dominios variables VL y VH se sustituyen mutuamente.

2. Proteína biespecífica de unión a antígeno según la reivindicación 1, en la que dichos fragmentos Fab adicionales se fusionan mediante un péptido conector con los extremos C-terminales de las cadenas pesadas en a) o con los extremos N-terminales de las cadenas pesadas en a) .

3. Proteína biespecífica de unión a antígeno según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque en los fragmentos Fab se llevan a cabo las modificaciones siguientes:

i) en ambos fragmentos Fab de a) , o en ambos fragmentos Fab de b) , los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y/o 50 los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen mutuamente.

4. Proteína biespecífica de unión a antígeno según la reivindicación 3, caracterizada porque en los fragmentos Fab se llevan a cabo las modificaciones siguientes:

i) en ambos fragmentos Fab en a) los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y/olos dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro.

5. Proteína biespecífica de unión a antígeno según la reivindicación 4, caracterizada porque en los fragmentos Fab 60 se llevan a cabo las modificaciones siguientes: i) en ambos fragmentos Fab de a) los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro.

6. Proteína biespecífica de unión a antígeno según la reivindicación 3, caracterizada porque en los fragmentos Fab 5 se llevan a cabo las modificaciones siguientes:

i) en ambos fragmentos Fab en b) los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y/o los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen mutuamente.

7. Proteína biespecífica de unión a antígeno según la reivindicación 6, caracterizada porque en los fragmentos Fab se llevan a cabo las modificaciones siguientes:

i) en ambos fragmentos Fab en b) 15 los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen mutuamente.

8. Método para la preparación de una proteína biespecífica de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 7, que comprende las etapas siguientes:

a) transformar una célula huésped con vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de una proteína biespecífica de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 7,

b) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permiten la síntesis de dicha molécula de proteína de unión a antígeno, y

c) recuperar dicha molécula de proteína de unión a antígeno a partir de dicho cultivo.

9. Célula huésped que comprende los vectores según la reivindicación 8.

10. Composición farmacéutica que comprende la proteína biespecífica de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 7 y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. Proteína biespecífica de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 7, destinada al tratamiento del cáncer.

12. Utilización de la proteína biespecífica de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 7, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer.