Proteína inversa.

Proteína seleccionada de las secuencias de aminoácidos

SEQ ID NO:

1

(NH2)Ala-Ile-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Gly-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val(COOH); y

SEQ ID:NO: 2

(NH2)Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Gly-Gly-Cys-Pro-Ser(COOH),

en donde, en cada caso, se presenta un cierre en anillo mediante la unión entre dos residuos de cisteína.

Proteína inversa La presente invención se refiere a una proteína inversa, esto es, una proteína (polipéptido) de factor de necrosis tumoral, que está compuesto N-terminalmente de una o más partes C-terminales de la secuencia de aminoácidos del factor de necrosis tumoral (TNF) maduro, y C-terminalmente de una o más partes N-terminales de la secuencia de aminoácidos del TNF, en donde la proteína se puede usar como un medicamento, por ejemplo, para el tratamiento de edemas pulmonares.

El transporte de líquidos a través de capas de células y tejidos se basa principalmente en un gradiente osmótico mediante un transporte de iones vectorial activo, por ejemplo, transporte de sodio. Este se lleva a cabo principalmente a través de canales iónicos estrictamente regulados y vitalmente importantes, como por ejemplo, el complejo del canal de sodio epitelial (ENaC) . El agua sigue a este gradiente de forma pasiva, entre otros, a través de canales de agua especiales, tal como el canal de agua acuaporina V. Para el tejido pulmonar se sabe que, basolateralmente en las células que bombean, las Na+/K+ ATPasas dirigen el transporte vectorial de sodio en los intersticios y finalmente de los iones en los vasos linfáticos y sanguíneos. Este transporte también es activo y se realiza independientemente de la presión transpulmonar y la concentración de proteína alveolar.

Un edema es una acumulación patológica de líquido en un órgano, como por ejemplo, en los pulmones, pero también en el cerebro o en la piel. Un edema en los pulmones se denomina edema pulmonar. El edema pulmonar se basa principalmente en el desequilibrio entre extravasación de líquido y resorción de líquido. Con mucha frecuencia también está dañada la permeabilidad del tejido pulmonar, de modo que tiene lugar un suministro aumentado de líquido, y el líquido se acumula en los alveolos pulmonares.

Tal trastorno de la permeabilidad como consecuencia de una falta de transporte de vuelta de líquido de los alveolos pulmonares al intersticio es especialmente significativo para la lesión pulmonar aguda (ALI, por sus siglas en ingles)

o para el síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS, por sus siglas en ingles) o para el síndrome respiratorio agudo grave (SRAG) o para la neumonía y para la insuficiencia multiorgánica. Sin embargo, la deficiencia en permeabilidad también desempeña un papel en otras enfermedades pulmonares, tales como lesiones pulmonares inducidas por la respiración, trasplantes de pulmón, lesiones pulmonares asociadas a transfusiones, administración terapéutica de IL-2 o asma.

Como resultado de una acumulación elevada de líquido en tejidos u órganos, por ejemplo, en los pulmones, el necesario intercambio de gases se dificulta o se restringe por completo. No llega oxígeno del aire respirado a la sangre, de modo que se pueden presentar lesiones orgánicas que ponen en peligro la vida debido a la falta de oxígeno.

No existe ninguna terapia estándar general para el tratamiento del edema de permeabilidad. En general, se intenta dar respiración artificial a los pacientes con un edema pulmonar, para garantizar el suministro de oxígeno a la sangre y por consiguiente a los órganos.

A partir del documento DE 38 41 759 se conocen péptidos individuales derivados de TNF.

Carswell et al., en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3666, 1975 describieron que el suero de animales tratados con endotoxina, que anteriormente se habían infectado con la cepa micobacteriana de Calmette-Guerin (BCG) , produjo una necrosis hemorrágica en diferentes tumores en ratones. Esta actividad se atribuyó al factor de necrosis tumoral (TNF) . El TNF también muestra un efecto citostático o citotóxico in vitro frente a un gran número de líneas celulares transformadas, mientras que el mismo no afectaba a las líneas celulares humanas y animales normales (M. R. Ruff et al, Lymphokines, Vol. II, Academic Press Inc., Nueva York, 1981, pp. 235-275) . La caracterización bioquímica y el gen para el TNF humano ya se han descrito (D Pennica et al, Nature 312, 724, 1984; Aggarwal, B. B. et al, J. Biol. Chem. 260, 2334-2345, 1985; Nedwin, G.E. et al, Nucl. Acids Res. 13, 6361, 1985) .

A partir de estos datos se pudo deducir la siguiente estructura proteica para el factor de necrosis tumoral (TNF) maduro humano:

Además, se ha descrito el gen de TNF bovino, de conejo y de ratón (Goeddel D. V. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 597, 1986) . 5 Además de sus propiedades citotóxicas, el TNF desempeña un papel fundamental en las reacciones inflamatorias (J.W. Larrick et al, Pharmac. Res. Vol. 5, No. 3, 129-139, 1988) . En modelos animales se pudo mostrar la participación del TNF en el choque séptico (Torti F. M. et al, Science 229, 867-869, 1985) y la enfermedad del injerto contra el huésped (Piquet, P F et al, J. Exp. Med. 166, 1280, 1987) .

Se sabe a partir de análisis bioquímicos que el TNF humano consta de diferentes elementos estructurales, como se enumeran en la tabla 1:

TABLA 1

Elemento estructural Posición de los aminoácidos

CADENA º 1 30-32

CADENA º 2 45-49

CADENA º 3 54-71

CADENA º 4 76-83

CADENA º 5 85-87

CADENA º 6 91-98

CADENA º 7 101-103

Giro en U 8 104-106

CADENA º 9 107-109

CADENA º 1 0 113-126

CADENA º 1 1 131-137

HÉLICE a 12 139-141

CADENA º 1 3 147-153

En Lucas R et al, Science (1994) Vol. 263. no. 5148, pp. 814-817 se describe un péptido que deriva de la región Ser (99) a Glu (116) de TNF, y el cual se propone para el tratamiento de edemas. Este péptido también es el objeto del documento WO 00/09149. Sin embargo, para hacer útil este péptido del documento WO 00/09149, se debió sustituir de forma artificial la posición Pro (100) por el aminoácido cisteína y la posición Cys (101) por el aminoácido glicina. Puesto que el péptido lineal Ser (99) a Glu (116) no tenía ningún efecto según la invención (Hribar M. et al., Eur. J. Immunol. (1999) , Vol.29, 3105-3111; Braun C., J. Immunol. (2005) , 175: 3402-3408; Fukuda N. et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol (2001) 280: L1258-L1265) , se tuvo que sustituir además la posición Glu (116) por el aminoácido cisteína, para mantener la estructura y para permitir un cierre en anillo entre ambos aminoácidos cisteína.

Una desventaja del péptido descrito en el documento WO00/09149 consiste en que dicho péptido contiene secuencias de aminoácidos artificiales, es decir que no están contenidas en el TNF en esta forma. Tal péptido provisto de estructuras artificiales será reconocido por el sistema inmune humano como exógeno. Una administración repetida o permanente de tal péptido en forma de medicamento puede provocar reacciones inmunes potencialmente mortales.

Se ha encontrado ahora, sorprendentemente, que una proteína, que está compuesta de partes de la secuencia de aminoácidos del factor de necrosis tumoral (TNF) maduro muestra propiedades biológicas interesantes, en donde tal proteína no contiene ninguna secuencia de aminoácidos artificial.

En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína, seleccionada de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1, (NH2) Ala-Ile-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Gly-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-al (COOH) ; y SEQ ID:NO:2 (NH2) Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Gly-GlyCys-ProSer (COOH) , en donde, en cada caso, existe un cierre en anillo a través de la unión entre dos residuos de cisteína.

El factor de necrosis tumoral (TNF) maduro como se usa en el presente documento, es preferiblemente el factor de necrosis tumoral humano.

Una proteína que se proporciona según la invención, también se denomina en el presente documento como “proteína según (de) la presente invención”.

Las partes de la secuencia de aminoácidos del factor de necrosis tumoral (TNF) maduro también se denominan en el presente documento como “elementos estructurales del factor de necrosis tumoral (TNF) ”.

Una proteína según la presente invención está compuesta N-terminalmente de uno o más elementos estructurales C-terminales del factor de necrosis tumoral maduro y C-terminalmente de uno o más elementos estructurales Nterminales del factor de necrosis tumoral maduro, por ejemplo, en forma de una proteína de fusión.

Los elementos estructurales del factor de necrosis tumoral maduro se definen en la tabla 1.

Una proteína según la presente invención incluye una proteína de fusión compuesta de partes de la secuencia de aminoácidos del TNF humano como se ha definido anteriormente, por ejemplo, de elementos estructurales del TNF.

Además, se ha encontrado que es... [Seguir leyendo]

1. Proteína seleccionada de las secuencias de aminoácidos 5

SEQ ID NO: 1

(NH2) Ala-Ile-Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Gly-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val (COOH) ; y

SEQ ID:NO: 2 (NH2) Lys-Ser-Pro-Cys-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Gly-Gly-Cys-Pro-Ser (COOH) ,

en donde, en cada caso, se presenta un cierre en anillo mediante la unión entre dos residuos de cisteína.

2. Proteína según la reivindicación 1 en forma de una sal.

3. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, para su uso como medicamento.

4. Proteína según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 3, para su uso en el tratamiento de edemas 20 pulmonares.

5. Composición farmacéutica, caracterizada en que comprende una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.