Producción recombinante de mezclas de anticuerpos.

Un método para identificar al menos un clon de célula hospedadora que produce una mezcla deanticuerpos,

en donde dicha mezcla de anticuerpos tiene un efecto deseado de acuerdo con un ensayo funcional,comprendiendo el método las etapas de:

(i) proporcionar una célula hospedadora con una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena ligera ysecuencias de ácidos nucleicos que codifican dos cadenas pesadas diferentes, en donde dichas cadenas pesadas yligera son capaces de emparejarse entre sí;

(ii) cultivar al menos un clon de dicha célula hospedadora en condiciones que conducen a la expresión dedichas secuencias de ácidos nucleicos;

(iii) someter a cribado dicho al menos un clon de la célula hospedadora para la producción de una mezcla deanticuerpos que tienen el efecto deseado mediante un ensayo funcional; y

(iv) identificar al menos un clon que produce una mezcla de anticuerpos que tiene el efecto deseado.

Producción recombinante de mezclas de anticuerpos Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la medicina, más en particular al campo de la producción de anticuerpos, más en particular, a la producción de mezclas de anticuerpos.

Fundamento de la invención.

La función esencial del sistema inmunitario es la defensa contra la infección. El sistema inmunitario humoral combate moléculas reconocidas como extrañas o non-self, tales como los agentes patógenos, utilizando inmunoglobulinas. Estas inmunoglobulinas, también llamadas anticuerpos, son producidas específicamente contra el agente infeccioso, que actúa como antígeno, al tener lugar el primer contacto (Roitt, Essential Immunology, Blackwell Scientific Publications, quinta edición, 1984) . Los anticuerpos son moléculas polivalentes que comprenden cadenas pesadas (Heavy: H) y cadenas ligeras (Light:L) unidas con enlaces disulfuro intercadenas. Se conocen varios isotipos de anticuerpos, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, e IgM. Una IgG contiene dos cadenas pesadas y dos ligeras. Cada cadena contiene regiones constantes (C) y variables (V) , que se pueden romper en dominios designados CH1, CH2 , CH3 , VH y CL, VL (Fig. 1) . El anticuerpo se une al antígeno por medio de los dominios de la región variable contenidos en la porción Fab, y después de la unión puede interaccionar con moléculas y células del sistema inmunitario a través de los dominios constantes, lo más frecuentemente a través de la porción Fc.

Los linfocitos B pueden producir anticuerpos en respuesta a la exposición a sustancias biológicas como las bacterias, los virus y sus productos tóxicos. Los anticuerpos son generalmente específicos del epítopo y se unen fuertemente a sustancias que llevan estos epítopos. La técnica del hibridoma (Kohler y Milstein 1975) emplea la capacidad de las células B para producir anticuerpos monoclonales contra antígenos específicos y subsiguientemente producen estos anticuerpos monoclonales fusionando las células B de ratones expuestos al antígeno de interés con las células plasmáticas murinas inmortalizadas. Como resultado de esta tecnología se cayó en la cuenta de que los anticuerpos monoclonales producidos por hibridomas podían ser usados en investigación, diagnóstico y terapias para el tratamiento de diferentes tipos de enfermedades como el cáncer y los trastornos autoinmunitarios relacionados.

Como los anticuerpos que son producidos en hibridomas de ratón inducen fuertes respuestas inmunitarias en los seres humanos, se ha apreciado en la técnica que los anticuerpos requeridos para el tratamiento con éxito de los seres humanos necesitan ser menos inmunogénicos o preferiblemente no inmunogénicos. Para esto, se diseñaron primero anticuerpos murinos reemplazando las regiones constantes murinas con regiones constantes humanas (denominados anticuerpos quiméricos) . Subsiguientemente, los dominios entre las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) en los dominios variables, las llamadas regiones marco, fueron reemplazados por sus contrapartidas humanas (denominados anticuerpos humanizados) . La etapa final en este proceso de humanización ha sido la producción de anticuerpos totalmente humanos.

En la técnica se han descrito también anticuerpos biespecíficos, que tienen especificidad de unión para dos antígenos diferentes. Estos se utilizan generalmente para dirigirse a un resto terapéutico o de diagnóstico, por ejemplo células T, una molécula desencadenante citotóxica o un quelante que se une a un radionucleido, que es reconocido por una región variable del anticuerpo contra una célula que es reconocida por la otra región variable del anticuerpo, por ejemplo, una célula tumoral (véase, para anticuerpos biespecíficos, Segal et al, 2001) .

Merchant et al (Nature Biotechnology, vol. 16, N º 7 (1998) , 677 - 681) describen la producción de una IgG biespecífica humana, en donde se usó una cadena ligera única y las cadenas pesadas fueron remodeladas para la heterodimerización usando enlaces disulfuro modificados en combinación con la tecnología de "botón en ojal" (knob into hole) . Se alcanzó un rendimiento de 95% de heterodímero.

Lenz y Weidle (Gene, vol. 87, N º 2 (1990) , 213 -218) describen un método para producir anticuerpos heterobifuncionales, en donde genes clonados que codifican un anticuerpo de interés son introducidos en una línea de células de hibridoma que segregan otro anticuerpo de interés. De esta forma se obtienen líneas celulares estables que segregan anticuerpos heterobiespecíficos.

Un método muy útil conocido en la técnica para obtener anticuerpos monoclonales completamente humanos con propiedades de unión deseables emplea bibliotecas de presentación de fago. Este es un método in vitro, basado en ADN recombinante, que imita las características clave de la respuesta inmunitaria humoral (para métodos de presentación de fagos, véase, por ejemplo, CF Barbas III et al, Phage Display, A laborator y manual, Cold Spring Harbor Laborator y Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001) . Para la construcción de bibliotecas de presentación de fago, colecciones de región variable de la cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal humano son expresadas en la superficie de partículas de bacteriófago, normalmente en formato Fv de cadena simple (scFv) o en formato Fab. Las grandes bibliotecas de fagos que expresan fragmentos de anticuerpos contienen típicamente más de 109 especificidades de anticuerpo y pueden ser ensambladas a partir de las regiones V de inmunoglobulina expresadas en los linfocitos B de individuos inmunizados o no inmunizados. Alternativamente, pueden ser construidas bibliotecas de presentación de fagos a partir de regiones variables de inmunoglobulina que han sido parcialmente ensambladas o reorganizadas in vitro para introducir diversidad adicional de anticuerpo en la biblioteca (bibliotecas semisintéticas) (De Kruif et al, 1995b) . Por ejemplo, las regiones variables ensambladas in vitro contienen tramos de ADN aleatorizado o parcialmente aleatorizado producidos sintéticamente en aquellas regiones de las moléculas que son importantes para la especificidad del anticuerpo.

La información genética que codifica los anticuerpos identificados por presentación de fago, se puede utilizar para clonar los anticuerpos en un formato deseado, p. ej. IgG, IgA o IgM, para producir el anticuerpo con métodos de ADN recombinante (Boel et al, 2000) .

Un método alternativo para proporcionar anticuerpos totalmente humanos utiliza ratones transgénicos que comprenden material genético que codifica un repertorio de inmunoglobulina humana (Fishwild et al, 1996; Mendez et al, 1997) . Tales ratones pueden ser inmunizados con un antígeno diana, y la respuesta inmunitaria resultante producirá anticuerpos totalmente humanos. Las secuencias de estos anticuerpos pueden ser usadas en métodos de producción recombinantes.

La producción de anticuerpos monoclonales se realiza de forma rutinaria mediante el uso de la expresión recombinante de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las cadenas H y L de los anticuerpos en células hospedadoras (véanse, p. ej., los documentos EP0120694; EP0314161; EP0481790; Patente de EE.UU. 4.816.567; y el documento WO 00/63403) .

Hasta ahora, muchas diferentes enfermedades están siendo tratadas con anticuerpos monoclonales bien sea humanizados o bien completamente humanos. Los productos basados en anticuerpos monoclonales que están actualmente aprobados para su uso en seres humanos incluyen Herceptin™ (anti-Her2/Neu) , Reopro™ (antireceptor de glicoproteína IIb/IIIa) , Mylotarg™ (anti-CD33) , Rituxan™ (Rituximab, anti-CD20) , Simulect™ (anti-CD25) , Remicade™ (anti-TNF) , Synagis™ (anti-RSV) , Zenapax™ (receptor de IL2) , CAMPATH™ (anti-CD52) . A pesar de estos éxitos, hay todavía espacio para nuevos productos de anticuerpos y para una mejora considerable de los productos de anticuerpos existentes. El uso de anticuerpos monoclonales en el tratamiento del cáncer ha demostrado que pueden surgir las denominadas "variantes tumorales de pérdida de antígeno", haciendo menos eficaz el tratamiento con el anticuerpo monoclonal. El tratamiento con el anticuerpo monoclonal Rituximab (anti-CD20) , de mucho éxito, ha demostrado por ejemplo que pueden producirse variantes de escape de pérdida de antígeno que conducen a la recidiva del linfoma (Massengale et al, 2002) . En la técnica, la potencia de los anticuerpos monoclonales se ha visto incrementada fusionándolos con compuestos tóxicos, tales como radionucleidos, toxinas, citocinas, y similares. Cada uno de estos planteamientos sin embargo, tiene sus limitaciones, incluyendo... [Seguir leyendo]

1. Un método para identificar al menos un clon de célula hospedadora que produce una mezcla de anticuerpos, en donde dicha mezcla de anticuerpos tiene un efecto deseado de acuerdo con un ensayo funcional, comprendiendo el método las etapas de:

(i) proporcionar una célula hospedadora con una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena ligera y secuencias de ácidos nucleicos que codifican dos cadenas pesadas diferentes, en donde dichas cadenas pesadas y ligera son capaces de emparejarse entre sí;

(ii) cultivar al menos un clon de dicha célula hospedadora en condiciones que conducen a la expresión de dichas secuencias de ácidos nucleicos;

(iii) someter a cribado dicho al menos un clon de la célula hospedadora para la producción de una mezcla de anticuerpos que tienen el efecto deseado mediante un ensayo funcional; y

(iv) identificar al menos un clon que produce una mezcla de anticuerpos que tiene el efecto deseado.

2. El método según la reivindicación 1ª, en donde dicho cultivo en la etapa (ii) y dicho cribado en la etapa (iii) se realizan con al menos dos clones.

3. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª y 2ª, en donde dicha célula hospedadora es capaz de expresión a alto nivel de proteínas sin necesidad de amplificación del ácido nucleico que codifica dichas proteínas en dicha célula.

4. Un método para preparar una mezcla de anticuerpos, que comprende la etapa de:

(i) cultivar un clon de célula hospedadora identificado por un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 3ª bajo condiciones que conducen a la expresión de los ácidos nucleicos que codifican la cadena ligera y las dos cadenas pesadas diferentes.

5. Un método según la reivindicación 4ª, que comprende además la etapa de: (ii) recuperar la mezcla de anticuerpos de la célula hospedadora o del cultivo de la célula hospedadora.

6. Un método para preparar una célula hospedadora recombinante para la producción de una mezcla de

anticuerpos, comprendiendo el método la etapa de introducir secuencias de ácido nucleico que codifican dos cadenas pesadas diferentes en una célula hospedadora recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena ligera común capaz de emparejarse con las dos cadenas pesadas, dando como resultado solamente regiones de unión funcionales.

7. Un animal no humano transgénico o una planta transgénica que comprenden una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica una cadena ligera común y una secuencia o secuencias de ácido nucleico recombinante que codifica al menos dos cadenas pesadas diferentes que son capaces de emparejarse con dicha cadena ligera común, en donde dichas secuencias de ácido nucleico recombinante que codifican dichas cadenas ligera y pesadas están bajo el control de un promotor específico del tejido.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 3ª, en donde la secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican al menos una de dichas cadenas ligera común y/o pesadas han sido obtenidas por un método que comprende al menos una etapa de selección para la presentación de anticuerpo.

9. Un método para el cribado en relación con una mezcla de anticuerpos que es capaz de unirse a una diana, comprendiendo el método las etapas de:

i) poner una biblioteca de presentación de anticuerpos que comprende anticuerpos en contacto con material 40 que comprende una diana;

ii) al menos una etapa de seleccionar anticuerpos que se unen a dicha diana;

iii) identificar al menos dos anticuerpos que se unen a dicha diana, en donde dichos al menos dos anticuerpos comprenden una cadena ligera común;

iv) introducir una secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena ligera común y una secuencia de ácido 45 nucleico o secuencias de ácidos nucleicos que codifican dos cadenas pesadas de dichos al menos dos anticuerpos en una célula hospedadora;

v) cultivar un clon de dicha célula hospedadora bajo condiciones que conducen a la expresión de dichas secuencias de ácidos nucleicos;

vi) cribar dicho clon de dicha célula hospedadora en relación con la producción de una mezcla de anticuerpos 50 que tienen un efecto deseado mediante un ensayo funcional; y

(vii) identificar al menos un clon que produce una mezcla de anticuerpos que tienen el efecto deseado.

10. Un método para preparar una mezcla de anticuerpos en un hospedador recombinante, incluyendo el método la etapa de expresar en una célula hospedadora recombinante una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena ligera común y secuencia o secuencias de ácidos nucleicos que codifican dos cadenas pesadas diferentes que difieren en la región variable y que son capaces de emparejarse con dicha cadena ligera común, y en donde dichas cadenas pesadas difieren además en sus regiones constantes lo suficiente para reducir o prevenir el emparejamiento entre las diferentes cadenas pesadas.

11. Un método según la reivindicación 10ª, en donde dichas cadenas pesadas son de isotipo diferente.

12. Un método según la reivindicación 1ª, en donde dicho ensayo funcional se elige entre el grupo de ensayos de unión, ensayos de apoptosis, ensayos de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) , ensayos de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) , ensayos de inhibición del crecimiento o proliferación celular (efecto citostático) , ensayos de muerte de células (efecto citotóxico) , ensayos de señalización de células, ensayos para la medida de la inhibición de la unión de un agente patógeno a la célula diana, ensayos para la medida de la secreción del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) u otras moléculas segregadas, ensayos para la bacteriostasis, actividad bactericida, neutralización de virus, ensayos para medir la atracción de componentes del sistema inmunitario al sitio en donde se unen los anticuerpos, incluyendo métodos de hibridación in situ, métodos de marcaje, ensayos in vivo tales como modelos animales, incluyendo modelos tumorales en ratones, modelos de enfermedad autoinmunitaria, modelos en roedores en primates infectados por virus o infectados por bacterias.

13. Una mezcla de anticuerpos que comprenden una cadena ligera común y dos cadenas pesadas diferentes con una región variable diferente, en donde las dos cadenas pesadas diferentes son capaces de emparejarse con dicha cadena ligera común, y en donde dichas cadenas pesadas difieren además en sus regiones constantes lo suficiente como para que la cantidad de anticuerpos biespecíficos disminuya en comparación con el porcentaje teórico de anticuerpos biespecíficos.

14. Una mezcla de anticuerpos según la reivindicación 13ª, en donde dos anticuerpos de la mezcla se unen a epítopos diferentes en el mismo antígeno o se unen a diferentes moléculas de antígeno presentes en una mezcla que comprende antígenos.

15. Una mezcla de anticuerpos según una cualquiera de las reivindicaciones 13ª o 14ª u obtenible por un método según una cualquiera de las reivindicaciones 4ª, 5ª, 10ª o 11ª, para su uso en el tratamiento o el diagnóstico de una enfermedad o trastorno en un sujeto humano o animal.

16. Una composición farmacéutica que comprende la mezcla de anticuerpos según una cualquiera de las reivindicaciones 13ª o 14ª.

17. El uso de un mezcla de antibióticos, en donde están presentes dos cadenas pesadas diferentes y una cadena ligera común, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o el diagnóstico de una enfermedad

o trastorno en un sujeto humano o animal.

18. El uso de la reivindicación 17ª, en donde la mezcla es obtenible por un método según una cualquiera de las reivindicaciones 4ª, 5ª, 10ª o 11ª.

19. El uso según las reivindicaciones 17ª o 18ª, en donde la enfermedad o el trastorno se eligen entre el grupo de enfermedades autoinmunitarias, rechazo de injerto contra huésped, y cáncer, incluyendo tumores sólidos del cerebro, cabeza y cuello, mama, próstata, colon, pulmón, tumores hematológicos, tumores de células B, trastornos neoplásicos incluyendo leucemias, linfomas, sarcomas, carcinomas, tumores de células neuronales, carcinomas de células escamosas, tumores de células germinales, metástasis, tumores no diferenciados, seminomas, melanomas, mielomas, neuroblastomas, tumores de células mixtas, y neoplasias causadas por agentes infecciosos.

20. El uso según las reivindicaciones 17ª o 18ª, en donde la enfermedad o el trastorno son causados por una bacteria, virus u hongo, incluyendo S. aureus multirresistente, Candida albicans y Aspergillus sp., levaduras, Lyssavirus p. ej. virus de la rabia, virus varicela-zóster, adenovirus, virus sincitial respiratorio, virus de la inmunodeficiencia humana, metaneumovirus humano, virus de la influenza, virus del Nilo Occidental, el virus que causa el síndrome respiratorio agudo severo (SARS) , Bacillus anthracis, toxina de Clostridium botulinum, toxina épsilon de Clostridium perfringens, Yersinia pestis, Francisella tulariensis, Coxiella burnetii, Brucella especies, enterotoxina B de Staphylococcus, viruela mayor, alfavirus que causan síndromes de meningoencefalitis (EEEV, VEEV y WEEV) , virus conocidos por causar fiebres hemorrágicas tales como los virus Ebola, Marburg y Junin, o contra virus tales como el virus Nipah, Hantavirus, virus de la encefalitis transmitida por la garrapata y el virus de la fiebre amarilla, o contra toxinas p. ej. la toxina ricina de Ricinus communis.

21. El uso según la reivindicación 17ª o 18ª, en donde la enfermedad o el trastorno son causados por un parásito unicelular o multicelular.

22. Una composición farmacéutica que comprende una mezcla de anticuerpos producidos de forma recombinante y un vehículo adecuado, en donde dos cadenas pesadas diferentes y una cadena ligera común están representadas en dicha mezcla de anticuerpos producidos de forma recombinante, y con lo que las dos cadenas pesadas diferentes son capaces de emparejarse con dicha cadena ligera común.

Bisagra Fig. 3, continuación

Fig. 16B, continuación

Fig. 17, continuación

Péptido

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Péptido Poli-241

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