Producción de ADN lineal cerrado.

Un proceso sin células in vitro para la producción de un ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal cerrado quecomprende:

(a) poner en contacto un molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana de protelomerasa con almenos una ADN polimerasa en presencia de uno o más cebadores en condiciones que promuevan laamplificación de dicho molde; y

(b) poner en contacto ADN amplificado producido en (a) con al menos una protelomerasa en condiciones quepromuevan la producción de ADN lineal cerrado.

Producción de ADN lineal cerrado

Campo de la invención La presente invención se refiere a un proceso sin células in vitro para la producción de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal cerrado.

Antecedentes de la invención Los procesos basados en células tradicionales para amplificación de ADN en grandes cantidades son costosos. Por ejemplo, el uso de bacterias requiere su crecimiento en grandes volúmenes en fermentadores caros que se requiere que se mantengan en un estado estéril para evitar la contaminación del cultivo. Las bacterias también necesitan lisarse para liberar el ADN amplificado y es necesario que el ADN se limpie y purifique de otros componentes bacterianos. En particular, cuando se producen vacunas de ADN y otros agentes de ADN terapéuticos, se requiere alta pureza para eliminar la presencia de endotoxinas que sean tóxicas para mamíferos.

Además de los problemas de costes, el uso de bacterias puede en muchos casos presentar dificultades con respecto a la fidelidad del proceso de amplificación. En el complejo ambiente bioquímico de la célula bacteriana, es difícil controlar la calidad y rendimientos del producto de ADN deseado. Las bacterias pueden alterar ocasionalmente el gen requerido clonado dentro del ADN amplificado y hacerlo inservible para el fin requerido. Los acontecimientos de recombinación también pueden conducir a problemas en la producción fiel de un ADN de interés. Los procesos enzimáticos sin células para amplificación de ADN evitan el requisito de usar una célula hospedadora y por lo tanto son ventajosos.

Por ejemplo, la fabricación de casetes de ADN medicinales se basa casi exclusivamente en su inserción en plásmidos bacterianos y su amplificación en procesos de fermentación bacterianos.

Este proceso del estado de la técnica actual limita las oportunidades de mejorar la fabricación de tales medicinas de ADN de varias maneras. Además, el producto plasmídico es esencialmente una molécula de ADN en bruto porque contiene secuencias de nucleótidos no requeridas para su función medicinal. En consecuencia, en el campo de la producción de productos de ADN, tales como medicina de ADN, se necesita proporcionar métodos mejorados para la amplificación de ADN en grandes cantidades. En particular, existe la necesidad de proporcionar métodos mejorados para amplificación de formas específicas de ADN, tales como ADN lineales cerrados. Las moléculas de ADN lineal cerrado tienen utilidad particular para aplicaciones terapéuticas, ya que tienen estabilidad mejorada y seguridad frente a otras formas de ADN.

Heinrich et al (J. Mol Med (2002) 80: 648-654) describe que el mini ADN cerrado lineal generado por la enzima de escisión-unión procariota TelN es funcional en células de mamífero.

El documento US 2008/0305142 A1 describe biosíntesis sin células de ácido nucleico de alta calidad y usos del mismo.

Rodriguez (J. Mol Med (2004) 82: 500-509) describe vectores de ADN no virales para inmunización y diseño de terapia y métodos para su obtención.

Sumario de la invención La presente invención se refiere a un proceso para producción sin células in vitro de ADN cerrado covalentemente lineal (ADN lineal cerrado) . El proceso permite la producción potenciada de ADN cerrado covalentemente lineal en comparación con metodologías actuales que implican procesos celulares y amplificación dentro de plásmidos. Esto aumenta significativamente la productividad del proceso reduciendo a la vez el coste de purificación del producto.

De acuerdo con la presente invención, la producción de ADN cerrado covalentemente lineal a partir de un molde de ADN se lleva a cabo de forma enzimática en ausencia de una célula hospedadora. El ADN molde comprende al menos una secuencia diana de protelomerasa. El ADN molde se pone en contacto con al menos una ADN polimerasa en presencia de uno o más cebadores en condiciones que promuevan la amplificación del molde. El ADN amplificado a partir del molde se pone en contacto con al menos una protelomerasa en condiciones que promueven la producción de ADN lineal cerrado.

En consecuencia, la presente invención proporciona un proceso sin células in vitro para producción de un ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal cerrado que comprende:

(a) poner en contacto un molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana de protelomerasa con al menos una ADN polimerasa en presencia de uno o más cebadores en condiciones que promuevan la amplificación de dicho molde; y

(b) poner en contacto ADN amplificado producido en (a) con al menos una protelomerasa en condiciones que promuevan la producción de ADN lineal cerrado.

La invención se refiere además a un proceso de la invención en el que la ADN polimerasa y protelomerasa se proporcionan para su uso en la etapa (a) en forma de un kit.

Breve descripción de las figuras Figura 1: Replicación de ADN cerrado covalentemente lineal en bacteriófagos y el papel de la protelomerasa. A. Representación de ADN cerrado covalentemente lineal bacteriófago extracromosómico. * = Centro de la secuencia palindrómica del telómero. La secuencia R es una repetición palindrómica invertida de la secuencia L.

B. Replicación de ADN de bacteriófago en hospedador: la burbuja indica replicación de cadena de ADN. La síntesis de la cadena complementaria de R y L conduce a secuencias RL bicatenarias idénticas. C. Productos formados por acción de la protelomerasa. La protelomerasa se une a la secuencia RL y corta y liga las hebras opuestas en el punto central de la secuencia palindrómica para reformar los telómeros y completar la replicación del ADN cerrado covalentemente lineal original. Figura 2: La acción de la protelomerasa del fago N15 de Escherichia coli (TelN) en ADN bicatenario circular que contiene su sitio diana, telRL. TelRL es un palíndromo invertido con ramas derecha (telR) e izquierda (telL) de 28 pb indicadas por las flechas. Las secuencias subrayadas indican imperfecciones en el palíndromo telRL. Se requiere un palíndromo invertido perfecto de 22 pb central TelO para la unión de la enzima, TelN. TelN escinde esta secuencia de 22 pb en su punto medio y une los extremos de las hebras complementarias para formar extremos cerrados covalentemente. Figura 3: Comparación de secuencias diana de protelomerasa halladas en diversos organismos. Las secuencias dentro de cajas muestran el alcance de la secuencia palindrómica perfecta o imperfecta. El subrayado muestra imperfecciones en el palíndromo. Las secuencias de pares de bases destacadas son comunes para todas las secuencias diana de protelomerasa lo que indica su importancia para la unión y acción de protelomerasa. A. fago N15 de Escherichia coli. B. Fago Phi KO2de Klebsiella. C. Fago Py54 de Yersinia. Fago Phi HAP de Halomonas. E. Fago VP882 de Vibrio. Plásmido lpB31.16 de Borrelia burgdorferi. Las secuencias dentro de cajas muestran el alcance de las secuencias palindrómicas perfectas o imperfectas para cada bacteriófago. G. Se muestra la secuencia palindrómica inversa consenso para unión y acción de protelomerasa de bacteriófago. Esta es una secuencia repetida invertida perfecta de 22 pares de bases (11 pares de bases a cada lado del sitio de corte) . La secuencia consenso deriva de los restos destacados conservados mostrados para A-E. Se indican pares de bases conservados y sus posiciones en el palíndromo. Las líneas discontinuas indican flexibilidad en la composición de secuencia, es decir cuando las bases pueden ser N (A, T, C o G) . Figura 4: Proceso específico para amplificación in vitro de un ADN cerrado covalentemente bicatenario lineal usando una ADN polimerasa de desplazamiento de cadena RCA en combinación con protelomerasa TelN. A. Molde de ADN lineal cerrado. R y L representan las secuencias de ADN de las ramas derecha e izquierda de la secuencia de unión de protelomerasa TelN. B. Desnaturalización del molde de partida para formar ADN monocatenario circular. C. Unión de cebadores. D-E. Amplificación por círculo rodante a partir de molde de ADN monocatenario por una ADN polimerasa de desplazamiento de cadena RCA. F. Formación de ADN bicatenario concatemérico largo que comprende unidades individuales de molde amplificado separadas por secuencias de unión de protelomerasa (RL) . G. Contacto con protelomerasa TelN específica de la secuencia RL. La protelomerasa escinde el ADN concatemérico en el sitio RL y liga hebras complementarias para producir copias 45 amplificadas del molde de ADN cerrado covalentemente lineal original. Figura 5: Escisión de casete de ADN que expresa el gen de interés a partir de una molécula de ADN bicatenaria larga para crear un casete de ADN lineal cerrado. A. Molécula de ADN bicatenaria lineal que contiene un casete de ADN... [Seguir leyendo]

1. Un proceso sin células in vitro para la producción de un ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal cerrado que comprende: 5

(a) poner en contacto un molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana de protelomerasa con al menos una ADN polimerasa en presencia de uno o más cebadores en condiciones que promuevan la amplificación de dicho molde; y

(b) poner en contacto ADN amplificado producido en (a) con al menos una protelomerasa en condiciones que promuevan la producción de ADN lineal cerrado.

2. El proceso de la reivindicación 1, en el que dicho molde de ADN se incuba en condiciones que promueven la amplificación de dicho molde por desplazamiento de cadenas replicadas a través de replicación de otra cadena con desplazamiento de cadena.

3. El proceso de la reivindicación 2, en el que la amplificación de dicho molde se lleva a cabo por amplificación de círculo rodante (RCA) .

4. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que:

i) dichos cebadores son cebadores aleatorios; ii) dicha ADN polimerasa es phi29 de SEC ID Nº: 2 o una variante de la misma que comprende una secuencia que tiene al menos 80% de identidad con SEC ID Nº: 2; iii) dicha protelomerasa es TelN de bacteriófago N15 de SEC ID Nº: 15 o una variante de la misma que

comprende una secuencia que tiene al menos 80% de identidad con SEC ID Nº: 15; y/o iv) el ADN amplificado producido en la etapa (a) de la reivindicación 1 comprende concatémeros que comprenden unidades en tándem de la secuencia de ADN amplificada a partir de dicho molde de ADN.

5. El proceso de la reivindicación 4 (iv) , en el que dichos concatémeros se resuelven en unidades individuales de secuencia de ADN amplificada por dicha protelomerasa.

6. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que:

i) al menos una de dichas secuencias diana de protelomerasa comprende una secuencia de ADN de repetición 35 invertida perfecta; y/o ii) dicho molde de ADN es un ADN circular cerrado o un ADN lineal cerrado.

7. El proceso de acuerdo con la reivindicación 6 (ii) , en el que dicho molde de ADN lineal cerrado se incuba en condiciones desnaturalizantes para formar un ADN circular cerrado.

8. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que:

i) dicho molde de ADN comprende un casete de expresión que comprende un promotor eucariota unido operativamente con una secuencia codificante de interés; o 45 ii) dicho molde de ADN comprende un casete de expresión que comprende un promotor eucariota unido operativamente con una secuencia codificante de interés y una secuencia de terminación de la transcripción eucariota; y/o iii) dicho molde de ADN comprende un casete de expresión que comprende un promotor eucariota unido operativamente con una secuencia codificante de interés, en el que dicha secuencia codificante de interés es una secuencia codificante humana o una secuencia codificante de un patógeno que infecta a seres humanos.

9. El proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho casete de expresión está flanqueado en uno de los dos lados por una secuencia diana de protelomerasa.

10. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 9, que es para la producción de un ADN de casete de expresión lineal cerrado.

11. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además purificar el ADN lineal cerrado producido en la etapa (b) .

12. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende:

(a) poner en contacto dicho molde de ADN monocatenario que tiene una secuencia diana de protelomerasa que se escinde y se vuelve a unir por TelN de SEC ID Nº: 15 con ADN polimerasa phi29 de SEC ID Nº: 2, o una 65 variante de la misma que comprende una secuencia que tiene al menos 80% de identidad con SEC ID Nº: 2 a una temperatura de 25 a 35 grados centígrados en condiciones que promuevan la amplificación de dicho molde por dicha ADN polimerasa; y

(b) poner en contacto concatémeros producidos en la etapa (a) con dicha protelomerasa TelN, o una variante de la misma que comprende una secuencia que tiene al menos 80% de identidad con SEC ID Nº: 15 a una temperatura de 25 a 35 grados centígrados en condiciones que promuevan la actividad de dicha protelomerasa.

13. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicha secuencia diana de protelomerasa comprende la secuencia de SEC ID Nº: 25.

14. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la ADN polimerasa y 10 protelomerasa se proporcionan para su uso en dicho proceso en forma de un kit.

15. Un proceso para realizar una composición farmacéutica que comprende una molécula de ADN lineal cerrada, comprendiendo dicho proceso llevar a cabo un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, y formular el ADN lineal cerrado resultante con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.