Proceso de purificación preparatoria de furina humana.

Método para purificar un polipéptido de furina o un polipéptido de furina truncada a partir de una soluciónproteínica,

que comprende los siguientes pasos:

a) unir dicho polipéptido de furina o polipéptido de furina truncada a una resina mixta de intercambiocatiónico/interacción hidrófoba con potencial para unirse al polipéptido de furina o polipéptido defurina truncada a pH 6,0, y

b) recuperar el polipéptido de furina o polipéptido de furina truncada de la resina por elución.

Proceso de purificación preparatoria de furina humana.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a procesos de purificación de furina humana recombinante o de furina humana truncada utilizada para el procesamiento de proteínas precursoras inactivas con el fin de obtener proteínas maduras.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La familia de las convertasas proproteínicas análogas a la subtilisina de mamífero proteolíticas (SPC o PC) es homóloga a las subtilisinas bacterianas y de levadura Kex2p. Hasta la fecha se han identificado siete miembros distintos de la familia de las SPC, incluyendo furina, PC1 (también conocida como PC3) , PC2, PACE4, PC4, PC5 (también conocida como PC6) , PC7 (LPC, PC8 o SPC7) . Cada una de ellas presenta una distribución tisular única.

Todas las SPC son enzimas multidominio, compuestas por un propéptido amino-terminal, un dominio catalítico similar a la subtilisina, un dominio medio y un término carboxi único compuesto por uno o más dominios. Los dominios propéptido, catalítico y medio son esenciales y suficientes para la actividad catalítica. Se cree que los dominios carboxi-terminales contienen información para dirigirse correctamente y concentrarse en el compartimento de la vía secretora en la que funcionan las enzimas.

Estas proteínas están implicadas en el proceso de maduración endoproteolítico de proteínas precursoras inactivas, incluyendo hormonas, factores de crecimiento, receptores, proteínas virales y bacterianas y proteínas plasmáticas, como albúmina, factor von Willebrand (VWF) , factor VII, factor IX y factor X, en sitios de consenso básico simples, emparejados o múltiples (Nakayama, Biochem J. 1997; 327: 625-35) .

El miembro de las SPC furina, también llamado PACE (paired basic amino acid cleavage enzyme - enzima de disociación de aminoácidos básicos emparejados) se expresa en todos los tejidos y líneas celulares de mamíferos y es capaz de procesar una amplia gama de proteínas precursoras bioactivas en la vía secretora, incluyendo también hormonas, factores de crecimiento, receptores, proteínas virales y bacterianas y proteínas plasmáticas. Se trata de una endoproteasa de serina calcio-dependiente dispuesta estructuralmente en varios dominios, a saber: un péptido señal, propéptido, dominio catalítico, dominio medio (también denominado dominio homo-B o P) , el dominio rico en cisteína situado en el extremo C, dominio transmembrana y cola citoplasmática. El sitio de disociación de la proteasa de furina incluye una secuencia de reconocimiento caracterizada por la secuencia de aminoácidos Arg-X-Lys/Arg-Arg (Hosaka y col., J Biol Chem. 1991; 266:12127-30) .

Una furina intacta se incorpora en el sistema de membrana del aparato de Golgi, donde es funcionalmente activa (Bresnahan y col., J Cell Biol. 1990; 111: 2851-9) . Con el tránsito del precursor de furina recién sintetizado desde el retículo endoplasmático al aparato de Golgi, el propéptido se elimina autocatalíticamente en un procesamiento en dos etapas (Anderson y col., EMBO J. 1997; 16: 1508-18) .

La furina también efectúa ciclos entre la red trans-Golgi y la superficie celular a través de las vesículas endosomales, procesando así las dos proteínas precursoras durante su transporte a través de la vía secretora constitutiva, así como moléculas que entran en la vía endocítica. La distribución celular de furina en los compartimentos de procesamiento está dirigida por características estructurales definidas dentro de su cola citoplasmática (Teuchert y col., J. Biol. Chem. 1999; 274: 8199-07) .

Dado que una sobreexpresión de la proteasa afecta negativamente al crecimiento de cultivos celulares de crecimiento continuo, se han buscado soluciones para reducir la influencia tóxica de la furina en las células. Se ha comprobado que los dominios C-terminales son prescindibles para la actividad funcional de la furina y se ha podido detectar una forma truncada de la furina nativa sobreexpresada de 75-80 kD en el sobrenadante celular como proteína segregada (Wise y col., PNAS. 1990; 87: 9378-82) . Esta furina truncada segregada de forma natural también es conocida como “shed furin” (furina recortada) (Vidricaire y col, Biochem Biophys Res Comm. 1993; 195: 1011-8; Plaimauer y col., Biochem J. 2001; 354: 689-95) y está disociada en el extremo N de la porción transmembrana (Vey y col., J Cell Biol. 1994; 127: 1829-42) .

Ya se han descrito proteínas de furina truncadas por ingeniería genética, donde se ha eliminado la parte codificadora de los dominios transmembrana y citoplasmático, por ejemplo para los aminoácidos º714-794 (Leduc y col., J Biol Chem. 1992; 267: 14304-8; Molloy y col., J Biol Chem. 1992; 267: 16396-402) , para los aminoácidos º716-794 ("Sol-PACE", Wasley y col., J Biol Chem. 1993; 268: 8458-65; Rehemtulla y Kaufman, Blood. 1992; 79: 2349-55) y para los aminoácidos º705-794 (Hatsuzawa y col., J Biol Chem. 1992; 267: 16094-9) . También se han descrito mutantes de furina que comprenden una deleción de la región rica en cisteína (Hatsuzawa y col., J Biochem. 1992; 101: 296301; Creemers y col., J Biol Chem. 1993; 268: 21826-34) .

Para el uso biotecnológico in vitro se pueden concebir tanto aplicaciones in vitro como aplicaciones in vivo de SPC, incluyendo una aplicación dentro del marco del tratamiento terapéutico. Para estas aplicaciones, la furina humana o la furina truncada pueden ser más adecuadas que las endopeptidasas de origen no humano.

La furina o la furina truncada puede ser aplicable en la producción comercial de todo tipo de sustancias biológicamente activas (por ejemplo, otras enzimas) si ésta incluye un procesamiento como paso de producción. Por ejemplo, la Universidad de Leuven mantiene patentes para la aplicación de furina en la producción industrial de productos biomédicos relevantes (Pat. US nº 5.989.856, 5.935.815 y 6.274.365) .

Otro ejemplo es el procesamiento de pro-VWF. En realidad, la actividad endoproteolítica de la furina y su selectividad por los aminoácidos básicos se determinó primero en experimentos con pro-VWF. El pro-VWF es un propolipéptido de 741 aminoácidos y un VWF maduro de 2.050 aminoácidos (Verweij y col., EMBO J. 1986; 5: 183947) y es procesado en su forma madura por furina producida de modo endógeno (Wise y col., PNAS 1990; 87: 937882; Van de Ven y col., Mol Biol Rep. 1990; 14: 265-75; Rehemtulla y Kaufman, Blood. 1992; 79: 2349-55) . Dado que en el proceso aguas abajo el VWF recombinante (VWFr) consiste hasta en un 50-70% en pro-VWFr, el pro-VWFr no madurado por completo ha de ser procesado adicionalmente in vitro. La maduración de pro-VWFr se puede lograr mediante la adición de sobrenadante de células CHO con contenido en furina no purificada al sobrenadante de pro-VWFr no purificado. Sin embargo, debido a las bajas concentraciones de pro-VWFr y furina, este proceso de maduración puede llegar a durar varios días y no es bien reproducible. Por consiguiente, para este proceso de maduración sería preferible una furina purificada o un derivado de furina purificado.

A pesar del uso generalizado potencial de la furina o de la furina truncada en la maduración de proteínas, sorprendentemente sólo existen unas pocas descripciones de métodos para purificar furina.

La furina de ratón truncada recombinante ha sido purificada únicamente mediante un factor 7 con un rendimiento de un 27% por purificación con una membrana de intercambio aniónico seguida de columnas Mono Q y Superose 12 (Cameron y col., J Biol Chem. 2000; 275: 36741-9) .

Hatsuzawa y col. (J Biol Chem. 1992; 267: 16094-9) lograron una purificación en un factor 100 de furina de ratón truncada en células CHO con un rendimiento relativamente bajo, de aproximadamente un 10%, utilizando fraccionamiento de sulfato de amonio, fraccionamiento por lotes con AF-Blue Toyopearl y cromatografía con DEAE-Toyopearl. El mismo método fue utilizado también por Nakayama y col., tal como se publicó en Methods Enzymol. 1994; 244: 167-75.

Bravo y col. (J Biol Chem. 1994; 269: 25830-25837) describen la purificación de furina humana truncada a partir de sobrenadante de células de insecto dializado mediante Q-sepharose.

Sin embargo, debido al uso de varios pasos consecutivos, todos estos métodos requieren un tiempo relativamente largo, tienen un bajo grado de purificación o presentan un bajo rendimiento en furina. Estos métodos de purificación de furina no son útiles para un proceso industrial a gran escala donde la furina sólo es necesaria por encima de la proteína a preparar. Por consiguiente, en la técnica existe una gran necesidad de un proceso rápido para la purificación de furina en combinación con un alto grado de purificación y... [Seguir leyendo]

1. Método para purificar un polipéptido de furina o un polipéptido de furina truncada a partir de una solución proteínica, que comprende los siguientes pasos:

a) unir dicho polipéptido de furina o polipéptido de furina truncada a una resina mixta de intercambio catiónico/interacción hidrófoba con potencial para unirse al polipéptido de furina o polipéptido de furina truncada a pH 6, 0, y

b) recuperar el polipéptido de furina o polipéptido de furina truncada de la resina por elución.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho polipéptido de furina truncada es el polipéptido de furina de acuerdo con la SEQ ID Nº: 1.

3. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la elución es una elución escalonada.

4. Método según la reivindicación 3, caracterizado porque dicho polipéptido de furina o polipéptido de furina truncada se une a dicha resina mixta de intercambio catiónico/interacción hidrófoba en acetato de sodio 10 mM, CaCl2 1 mM, pH 6, 0, se lava con cloruro de sodio 30 mM, acetato de sodio 10 mM, CaCl2 1 mM, pH 6, 0, y se eluye con cloruro de sodio 230 mM, acetato de sodio 10 mM, CaCl2 1 mM, pH 6, 0.

5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque dicho polipéptido de furina o polipéptido de furina truncada se une a dicha resina mixta de intercambio catiónico/interacción hidrófoba en Hepes 50 mM, CaCl2 1 mM, pH 6, 0, se lava con cloruro de sodio 30 mM, Hepes 50 mM, CaCl2 1 mM, pH 6, 0, y se eluye con cloruro de sodio 230 mM, Hepes 50 mM, CaCl2 1 mM, pH 6, 0.

6. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la elución es una elución por gradiente.

7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque dicho gradiente es NaCl 0-500 mM en acetato de sodio 10 mM, CaCl2 1 mM, pH 6, 0.

8. Método para la recuperación de un polipéptido de furina o un polipéptido de furina truncada, que comprende los siguientes pasos:

a) unir dicho polipéptido de furina o polipéptido de furina truncada a una resina mixta de intercambio catiónico/interacción hidrófoba,

b) eluir dicho polipéptido de furina o polipéptido de furina truncada de la resina mixta de intercambio catiónico/interacción hidrófoba,

c) unir el polipéptido de furina o polipéptido de furina truncada eluido a resina de arginina-Sepharose, y

d) eluir dicho polipéptido de furina o polipéptido de furina truncada de la resina de arginina-Sepharose.

9. Método según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho polipéptido de furina truncada tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID Nº: 1.

Absorción [280 nm] Absorción [280 nm] Absorción [280 nm]

Figura 4