Procedimiento y composiciones para detectar específicamente moléculas poliméricas fisiológicamente aceptables.

Un procedimiento para la determinación del número de moléculas poliméricas fisiológicamente aceptables unidas a una proteína o a un complejo proteico en un conjugado de polímero-proteína,

que comprende las etapas de

detectar la unión entre

(i) un conjugado de polímero-proteína con uno o más polímeros unidos a la proteína, y

(ii) un anticuerpo que se une específicamente a dicho anticuerpo, detectable dicho anticuerpo cuando está unido a dicho conjugado de polímero-proteína,

en el que el número de polímeros del conjugado de polímero-proteína se correlaciona con los niveles de anticuerpo detectado unido al conjugado de polímero-proteína cuando se compara con un control conocido, y en el que el polímero fisiológicamente aceptable es polietilenglicol (PEG).

Procedimiento y composiciones para detectar específicamente moléculas poliméricas fisiológicamente aceptables Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de Patente de EE.UU. Nº61/009.327, depositada el 27 de diciembre de 2007.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento para determinar la cantidad de una molécula poliméricafisiológicamente aceptable unida a una proteína.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La función in vivo de una proteína se mejora uniéndola a una molécula polimérica fisiológicamente aceptable. En particular, se ha encontrado que la unión de una proteína fisiológicamente activa a una moléculapolimérica fisiológicamente aceptable prolonga sustancialmente su semivida in vivo. Por ejemplo, la Patente deEE.UU. 4.970.300 describe que la conjugación de una molécula polimérica fisiológicamente aceptable al factor VIII da como resultado una proteína de factor VIII que puede ser activada por la trombina y que tiene una antigenicidad yuna inmunorreactividad sustancialmente disminuidas, y un tiempo de desaparición in vivo sustancialmente aumentado en el torrente sanguíneo de un mamífero.

La Patente de EE.UU. 4.970.300 describe que la conjugación de una molécula polimérica (dextrano) alFactor VIII (FVIII) da como resultado una proteína de FVIII que puede ser activada por la trombina y que tiene una antigenicidad y una inmunorreactividad sustancialmente disminuidas, y un tiempo de desaparición in vivo sustancialmente aumentado en el torrente sanguíneo de un mamífero. La solicitud de patente internacionalWO94/15625 describe que la conjugación del factor VIII a una molécula polimérica fisiológicamente aceptablemejora la función in vivo del factor VIII (i) aumentando su resistencia a la hidrólisis in vivo, y prolongando su actividad después de su administración, (ii) prolongando significativamente su vida circulante in vivo con respecto a la proteínano modificada, y (iii) aumentando su tiempo de absorción en el torrente sanguíneo. La Patente de EE.UU. 6.037.452describe conjugados de FVIII y de Factor IX (FIX) en los que la proteína está unida covalentemente a un óxido depolialquileno a través de grupos carbonilo en la proteína. Además, se ha descrito la mejora de la función in vivo del factor IX mediante su unión a moléculas poliméricas fisiológicamente aceptables, en particular, polietilenglicol ("PEG") , en la solicitud de patente internacional WO94/29370. Se desveló un FVIII PEGilado que conserva suactividad específica en la Publicación de Patente Internacional WO/2007/126808. La conjugación de un polímerofisiológicamente aceptable con un agente activo tal como una proteína se realiza preparando conjugados establesde polímero-proteína o conjugados de polímero-proteína en los que el polímero fisiológicamente aceptable estáunido a la proteína a través de conectores covalentes escindibles (concepto de profármaco) , es decir, un conectorhidrolizable o escindible. Por ejemplo, se ha desarrollado una fracción de PEG escindible usando un sistema deconjugación con 9-flourenometoxicarbonilo (FMOC) que contiene dos cadenas de PEG (Nektar Inc., Huntsville AL) .Además, un grupo éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) , que es útil para la modificación química de residuos delisina de la proteína, puede estar unido al sistema anular de fluoreno a través del grupo metoxicarbonilo para generarla fracción escindible de PEG. La Publicación de Patente Internacional WO2008/082669 (incorporada en estedocumento como referencia) describe una serie of variantes PEGiladas del FVIII recombinante basadas en elconcepto de PEG escindible.

Sin embargo, actualmente no hay disponible un procedimiento fiable para la determinación cuantitativa demoléculas poliméricas fisiológicamente aceptables unidas a proteínas o nanopartículas, aparte de los imprecisosprocedimientos colorimétricos (Nag y col. 1997, Anal Biochem 250: 35 - 43) , que sólo permiten una estimación delcontenido de moléculas poliméricas fisiológicamente aceptables. Además, se han desvelado anticuerposmonoclonales para la determinación de las concentraciones de PEG (patente de EE.UU. 6.617.118) , pero hastaahora no hay disponible un sistema para la determinación fiable de la cantidad de molécula polimérica fisiológicamente aceptable unida a una proteína.

Por lo tanto, existe la necesidad de un nuevo sistema para determinar la cantidad de una moléculapolimérica fisiológicamente aceptable, en particular de PEG, unida a una proteína, particularmente a una proteínafisiológicamente activa.

Cheng y col., Bioconjugate Chem. 16, 1225 - 1231 (2005) y el documento US2004/0014156 desvelan unanticuerpo monoclonal que detecta PEG libre y proteínas modificadas con PEG y su uso para cuantificar moléculasderivatizadas con PEG. Wunderlich y col., Hybridoma 26, 168 - 172 (2007) también detallan la generación de unanticuerpo monoclonal reactivo frente a péptidos PEGilados. Tsai y col, BioTechniques 30, 396 - 402 (2001) desvelan la detección de beta-glucuronidasa modificada con PEG usando un anticuerpo reactivo frente al esqueleto de PEG. El documento WO02/094853 y Richter y Akerblom, Int. Arch. Allergy Appl. Immun. 70, 124 - 131 (1983) desvelan anticuerpos activos frente a PEG libre.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento para determinar la cantidad de una molécula poliméricafisiológicamente aceptable unida a una proteína. Adicionalmente, en este documento se proporciona un anticuerpocapaz de unirse específicamente a una molécula polimérica fisiológicamente aceptable en el que, por ejemplo, dichamolécula polimérica está presente unida a una proteína. Además, la presente memoria descriptiva se refiere al uso de dicho anticuerpo para la determinación de la cantidad de una molécula polimérica fisiológicamente aceptable unida a una proteína.

En un aspecto, la memoria descriptiva proporciona un procedimiento para la determinación de la cantidad de una molécula polimérica fisiológicamente aceptable unida a una proteína, que comprende las etapas de (a) proporcionar al menos una proteína unida a al menos una molécula polimérica fisiológicamente aceptable; (b) proporcionar al menos un anticuerpo capaz de unirse específicamente a dicha molécula polimérica fisiológicamenteaceptable; (c) poner en contacto el anticuerpo de la etapa (b) con la proteína de la etapa (a) en unas condicionesadecuadas para la unión de dicho anticuerpo a la al menos una molécula polimérica unida a dicha proteína; y (d) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo y la molécula polimérica fisiológicamente aceptable.

La invención está definida por las reivindicaciones. En un ejemplo, en la etapa (a) la proteína unida a la al menos una molécula polimérica fisiológicamente aceptable está inmovilizada sobre un sustrato o una matriz portadora.

En una forma de realización adicional, el anticuerpo se elige del grupo que consiste en un anticuerpopoliclonal y un anticuerpo monoclonal.

En otra forma de realización, la proteína es el factor de von Willebrand (VWF) o un derivado del mismo. Enuna forma de realización adicional, la proteína es el Factor VIII o un derivado del mismo.

Según la invención, la molécula polimérica fisiológicamente aceptable es polietilenglicol (PEG) .

En otro aspecto, la memoria descriptiva contempla un anticuerpo que es capaz de unirse específicamente auna molécula polimérica fisiológicamente aceptable. En un ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

En una forma de realización relacionada, la molécula polimérica fisiológicamente aceptable está unida a una proteína. En un ejemplo adicional, la proteína es el factor de von Willebrand (VWF) o un derivado del mismo.

En un aspecto adicional, la memoria descriptiva proporciona un kit para la determinación de la cantidad deuna molécula polimérica fisiológicamente aceptable unida a una proteína, que comprende un anticuerpo según sedescribe en este documento.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la determinación del número de moléculaspoliméricas fisiológicamente aceptables unidas a una proteína o a un complejo proteico en un conjugado depolímero-proteína, que comprende las etapas de detectar la unión entre (i) un conjugado de polímero-proteína conuno o más polímeros unidos a la proteína, y (ii) un anticuerpo que se une específicamente a dicho polímero, siendodicho anticuerpo detectable cuando está unido a dicho conjugado de polímero-proteína, en el que el número depolímeros del conjugado de polímero-proteína se correlaciona con los niveles de anticuerpo detectado... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la determinación del número de moléculas poliméricas fisiológicamente aceptablesunidas a una proteína o a un complejo proteico en un conjugado de polímero-proteína,

que comprende las etapas de detectar la unión entre

(i) un conjugado de polímero-proteína con uno o más polímeros unidos a la proteína, y

(ii) un anticuerpo que se une específicamente a dicho anticuerpo, detectable dicho anticuerpo cuando estáunido a dicho conjugado de polímero-proteína,

en el que el número de polímeros del conjugado de polímero-proteína se correlaciona con los niveles de anticuerpodetectado unido al conjugado de polímero-proteína cuando se compara con un control conocido, y en el que elpolímero fisiológicamente aceptable es polietilenglicol (PEG) .

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende un marcador detectable, en elque el marcador detectable se elige del grupo formado por una enzima, un marcador radiactivo, un fluoróforo, unreactivo denso en electrones, biotina, digoxigenina, haptenos y proteínas que se hacen detectables mediante laadición de cualquiera de estos marcadores.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el conjugado de polímero-proteína está unido a una matrizportadora antes de su unión al anticuerpo, en el que la matriz portadora se elige del grupo formado por un microportador, una partícula, una membrana, una tira, un papel, una película, una microesfera o una placa.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el nivel de anticuerpo detectado se mide como laabsorbancia del marcador detectable.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el conjugado de polímero-proteína se aísla usando unaelectroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y se transfiere a una membrana antesde la detección.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el número de polímeros en el conjugado de polímeroproteína se calcula basándose en el peso molecular del conjugado de polímero-proteína en comparación con uncontrol conocido.

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el peso molecular del complejo de polímero-proteína secorrelaciona con la subunidad de proteína que comprende la molécula polimérica.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la proteína o el complejo proteico esun factor de coagulación sanguíneo o un complejo con un factor de coagulación sanguíneo, o en el que el factor decoagulación sanguíneo o el complejo con un factor de coagulación sanguíneo es humano, o en el que el factor decoagulación sanguíneo se elige del grupo formado por Factor II, Factor III, Factor V, Factor VII, Factor VIII, Factor IX, Factor X, Factor XI, Factor XII, Factor XIII, Factor de von Willebrand, proteína C y antitrombina III, o en el que el complejo con el factor de coagulación sanguíneo es Factor VIII:VWF.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el polímero es escindible, o en el queel polímero es hidrolizable.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el PEG es desde 3 hasta 100 kDa, o en el que el PEGtiene un peso molecular en un intervalo desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 60 kDa, o en el queel PEG tiene un peso molecular en un intervalo desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 40 kDa, oen el que el PEG tiene un peso molecular en un intervalo desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 15kDa.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el PEG tiene un peso molecular en un intervalo desdeaproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 10 kDa.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el anticuerpo es un anticuerpopoliclonal.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el anticuerpo es un anticuerpomonoclonal.