Procedimiento rápido para identificar el microorganismo causante de una enfermedad infecciosa.
Un procedimiento para identificar bacterias patógenas responsables de infecciones,
comprendiendo el procedimiento extraer el ADN del microorganismo objetivo para la identificación,someter el ADN como molde a amplificación génica usando una combinación de los siguientes conjuntosde cebadores (B), (F) y (M) y analizar la combinación de las temperaturas de fusión (valores de Tm)específicos del microorganismo en comparación con las temperaturas de fusión (valores de Tm)específicas del microorganismo conocido,
donde la combinación de los conjuntos de cebadores (B), (F) y (M) se selecciona entre (I) o (II):
(I) una combinación en la que el conjunto de cebadores (B) comprende
el cebador (B1) de secuencia ID N.º 2 y secuencia ID N.º 3;
el cebador (B2) de secuencia ID N.º 4 y secuencia ID N.º 5;
el cebador (B3) de secuencia ID N.º 6 y secuencia ID N.º 7; y
el cebador (B4) de secuencia ID N.º 8 y secuencia ID N.º 9; y
en el que el conjunto de cebadores (F) comprende los cebadores (F1) de secuencia ID N.º 10 y secuenciaID N.º 11; y
en el que el conjunto de cebadores (M) comprende
los cebadores (M1) de secuencia ID N.º 12 y secuencia ID N.º 13;
los cebadores (M2) de secuencia ID N.º 14 y secuencia ID N.º 15;
o
(II) una combinación en la que el conjunto de cebadores (B) comprende
los cebadores (B5) de secuencia ID N.º 17 y secuencia ID N.º 18;
los cebadores (B6) de secuencia ID N.º 19 y secuencia ID N.º 20;
los cebadores (B7) de secuencia ID N.º 21 y secuencia ID N.º 22;
los cebadores (B8) de secuencia ID N.º 23 y secuencia ID N.º 24;
los cebadores (B9) de secuencia ID N.º 25 y secuencia ID N.º 26;
los cebadores (B10) de secuencia ID N.º 27 y secuencia ID N.º 28.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2007/053078.
Solicitante: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION UNIVERSITY OF TOYAMA.
Nacionalidad solicitante: Japón.
Dirección: 3190, GOFUKU,TOYAMA-SHI TOYAMA 9308555 JAPON.
Inventor/es: NIIMI,HIDEKI, KITAJIMA,ISAO.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/00 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
- C12N15/09 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
- G01N33/569 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus.
PDF original: ES-2426038_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Procedimiento rápido para identificar el microorganismo causante de una enfermedad infecciosa.
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a un procedimiento para la detección e identificación rápida de bacterias patógenas para tratar una infección (especialmente una septicemia) en fase temprana.
ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA
La septicemia es una infección sistémica grave. Es indispensable detectar e identificar la bacteria patógena en sangre para el diagnóstico definitivo de septicemia.
En los últimos años ha aumentado el número de pacientes graves que es probable que desarrollen septicemia con el avance de tratamientos médicos como la terapia para el cáncer y el trasplante de órganos.
Las bacterias multirresistentes como el Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) pueden causar septicemia desde el punto de vista de la infección nosocomial. Para seleccionar un fármaco antimicrobiano apropiado que salve la vida del paciente, es importante detectar e identificar la bacteria patógena en sangre tan pronto como sea posible en la práctica clínica.
Sin embargo, puesto que el procedimiento actual de detección microbiológica necesita al menos 18 horas para identificar la bacteria tras el envío de una botella de cultivo de sangre, es necesario realizar tratamiento provisional hasta obtener el resultado. Por tanto, el fármaco antimicrobiano se ha seleccionado necesariamente a ciegas.
Como resultado, pueden surgir bacterias multirresistentes debido al uso de un fármaco antimicrobiano de amplio espectro, o una situación en la que la vida del paciente séptico no pueda salvarse debido a que puede producirse una selección inadecuada del fármaco antimicrobiano.
Se ha descrito un procedimiento en el que se amplifica el ADN de la bacteria patógena responsable de la septicemia mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se hibrida el ADN amplificado de la bacteria patógena con una sonda nucleotídica específica de la especie bacteriana diana determinada provisionalmente para detectar e identificar la bacteria patógena (Documento de Patente 1) .
También se ha desarrollado la tecnología de PCR en tiempo real para conseguir una detección e identificación inmediatas (Documento de no Patente 1) .
[Documento de Patente 1] JP-A-6-90799
[Documento de no Patente 1) Journal of Analytical Bio-Science, Vol. 28, N.º 5 (2005) , págs. 400 a 404
En el documento WO 01/48237 se describe un procedimiento para detectar rápidamente el ADN bacteriano en una muestra mediante la técnica de PCR. En el documento se menciona el uso del análisis de la temperatura de fusión para una clasificación previa aproximada, por ejemplo, en bacterias gram positivas y gram negativas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
El principio básico de este procedimiento de exploración de la septicemia es la PCR en tiempo real usando una sonda de hibridación.
Sin embargo, es necesario preparar una sonda de hibridación específica para cada especie bacteriana cuando se utiliza este procedimiento. Por tanto, para identificar un gran número de bacterias patógenas es necesario preparar un gran número de sondas de hibridación.
Específicamente, puesto que el número de especies bacterianas que se detectan está determinado por el número de sondas que hay que preparar, es prácticamente imposible identificar una gama amplia de especies bacterianas.
Los inventores de la invención realizaron estudios exhaustivos sobre la aplicación de la diferencia en la temperatura de fusión (valor de Tm, por sus siglas en inglés) entre las especies bacterianas para identificar bacterias patógenas según el concepto teórico de que el valor de Tm viene determinado por la secuencia de bases en el método del vecino más cercano para completar la invención.
La invención proporciona un procedimiento para la detección e identificación rápida de bacterias patógenas que comprende extraer el ADN de un microorganismo, someter el ADN como molde a amplificación génica mediante PCR o similar usando un conjunto de cebadores específico y analizar la combinación de las temperaturas de fusión (valores de Tm) específicas para el microorganismo o la diferencia entre los valores de Tm.
Más específicamente, la invención es como se establece en las reivindicaciones adjuntas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
En la figura 1 se muestra una banda de un gel de electroforesis en agarosa.
MEJOR MODO DE REALIZAR LA INVENCIÓN
La invención se describe en detalle a continuación.
(1) Es sabido que el ARNr 16S de bacterias tiene siete u ocho regiones de secuencia de bases (20 a 40 bases) comunes a prácticamente todas las bacterias.
Se desarrollan, respectivamente, un cebador sentido y un cebador complementario para todas o algunas de estas regiones de secuencia de bases para preparar de una a siete regiones de amplificación génica, como se define en las reivindicaciones.
(2) La región de amplificación génica contiene aproximadamente de 150 a 200 bases. La secuencia de bases específica para cada bacteria permanece excluyendo las regiones de conservación comunes para las que se han desarrollado los cebadores.
Por tanto, se obtiene el valor de Tm específico para cada bacteria debido a la diferencia en la secuencia de bases. Se estima que cada bacteria tiene de uno a siete valores de Tm específicos.
Por tanto, se determinan de uno a siete valores de Tm correspondientes a cada tipo de bacteria y se almacenan en una base de datos.
Las bacterias desconocidas pueden identificarse utilizando la base de datos.
(3) Una infección bacteriana y su tipo (incluyendo SARM) o una infección fúngica y su tipo pueden identificarse usando de uno a seis cebadores específicos de hongos, cebadores spa y mecA para la identificación de SARM en combinación para bacterias patógenas desconocidas.
(4) Cuando se obtiene un producto génico inespecífico y muestra un valor de Tm próximo al valor de Tm deseado, puede obtenerse un resultado falso positivo.
En este caso, el producto obtenido mediante amplificación génica se coloca en un gel de agarosa y se determina la banda para realizar una doble comprobación del resultado.
Específicamente, la precisión de la exploración puede aumentarse empleando un sistema de doble comprobación utilizando un procedimiento de detección de amplificación génica conocido.
(5) Cuando se emplea la PCR en tiempo real como procedimiento de amplificación génica, la cantidad de bacterias puede determinarse relativamente antes y después del tratamiento utilizando la naturaleza cuantitativa de la PCR en tiempo real de modo que el efecto terapéutico puede monitorizarse de forma mejorada.
(6) Un aparato de PCR en tiempo real se clasifica como aparato para PCR en tiempo real con bloque calefactor que controla la temperatura usando un bloque calefactor y un aparato con baño de aire que controla la temperatura utilizando aire. Se produce un error en la medición del valor de Tm de ±0, 1 a 0, 3 °C cuando se usa un aparato de PCR en tiempo real con bloque calefactor (dependiendo del fabricante) y se produce un error de ±0, 4 en la medición del valor de Tm cuando se usa un aparato de PCR en tiempo real con baño de aire que corresponde a cada ciclo de medición.
Es preferible emplear un procedimiento que utilice un patrón diferencial entre los valores de Tm obtenidos mediante el mismo ciclo de medición para la determinación, de modo que la identificación de la especie bacteriana no se vea dificultada debido al error en la medición.
Los cebadores utilizados en la invención son los siguientes. Grupo de combinación 1 Se seleccionan cinco sitios de secuencia entre los sitios de secuencia comunes a los genes del ARNr 16S de todas las bacterias y se prepararon un cebador sentido y un cebador complementario para cada sitio.
Específicamente, se usan cebadores que incluyen todas o algunas de las secuencias de bases siguientes. (B1) Conjunto de cebadores que amplifica ADN que contiene 97 bases correspondientes a las bases 809 a 905 del gen del ARNr 16S de Escherichia coli (E. coli) (Secuencia ID N.º 1) . (cebador de bacterias 1: Bac.1) Secuencia ID N.º 2: GATTAGATACCCTGGTAGTCCACG (24 mer) sentido
Secuencia ID N.º 3: CCCGTCAATTCCTTTGAGTTT (21 mer) complementario (B2) Conjunto de cebadores que amplifica ADN que contiene 166 bases correspondientes a las bases 927 a 1092 del gen del ARNr 16S de E. coli (cebador de bacterias 2: Bac.2)
Secuencia ID N.º 4: AAACTCAAAGGAATTGACGGG (21 mer) sentido Secuencia ID N.º 5: CGCTCGTTGCGGGAC (15 mer) complementario (B3)... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un procedimiento para identificar bacterias patógenas responsables de infecciones, comprendiendo el procedimiento extraer el ADN del microorganismo objetivo para la identificación, someter el ADN como molde a amplificación génica usando una combinación de los siguientes conjuntos de cebadores (B) , (F) y (M) y analizar la combinación de las temperaturas de fusión (valores de Tm) específicos del microorganismo en comparación con las temperaturas de fusión (valores de Tm) específicas del microorganismo conocido,
donde la combinación de los conjuntos de cebadores (B) , (F) y (M) se selecciona entre (I) o (II) :
(I) una combinación en la que el conjunto de cebadores (B) comprende el cebador (B1) de secuencia ID N.º 2 y secuencia ID N.º 3; el cebador (B2) de secuencia ID N.º 4 y secuencia ID N.º 5; el cebador (B3) de secuencia ID N.º 6 y secuencia ID N.º 7; y el cebador (B4) de secuencia ID N.º 8 y secuencia ID N.º 9; y en el que el conjunto de cebadores (F) comprende los cebadores (F1) de secuencia ID N.º 10 y secuencia
ID N.º 11; y en el que el conjunto de cebadores (M) comprende los cebadores (M1) de secuencia ID N.º 12 y secuencia ID N.º 13; y los cebadores (M2) de secuencia ID N.º 14 y secuencia ID N.º 15; o
(II) una combinación en la que el conjunto de cebadores (B) comprende los cebadores (B5) de secuencia ID N.º 17 y secuencia ID N.º 18; los cebadores (B6) de secuencia ID N.º 19 y secuencia ID N.º 20; los cebadores (B7) de secuencia ID N.º 21 y secuencia ID N.º 22; los cebadores (B8) de secuencia ID N.º 23 y secuencia ID N.º 24; los cebadores (B9) de secuencia ID N.º 25 y secuencia ID N.º 26; los cebadores (B10) de secuencia ID N.º 27 y secuencia ID N.º 28; y los cebadores (B11) de secuencia ID N.º 29 y secuencia ID N.º30, y en el que el conjunto de cebadores (F) comprende los cebadores (F2) de secuencia ID N.º 31 y secuencia ID N.º 32; los cebadores (F3) de secuencia ID N.º 33 y secuencia ID N.º 34; los cebadores (F4) de secuencia ID N.º 35 y secuencia ID N.º 36; los cebadores (F5) de secuencia ID N.º 37 y secuencia ID N.º 38; los cebadores (F6) de secuencia ID N.º 39 y secuencia ID N.º 40 y
los cebadores (F7) de secuencia ID N.º 41 y secuencia ID N.º 42 y
en el que el conjunto de cebadores (M) comprende:
los cebadores (M3) de secuencia ID N.º 43 y secuencia ID N.º 44;
y
los cebadores (M4) de secuencia ID N.º 45 y secuencia ID N.º 46.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, siendo la PCR el método de amplificación génica.
3. El procedimiento según la reivindicación 2, siendo la PCR una PCR en tiempo real.
4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, usándose el ADN de una cepa estándar de Escherichia coli con una concentración constante como molde como control de referencia; y
midiéndose un valor de Tm de referencia en cada ciclo usando (B) el conjunto de cebadores que 15 pueden amplificar diversas regiones de los genes del ARNr 16S de todas las bacterias para corregir un error en el valor de Tm debido al aparato de medición.
5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, identificándose las bacterias patógenas utilizando la combinación de las diferencias entre los valores de Tm junto con la combinación de los valores de Tm como algoritmo de identificación de bacterias patógenas para minimizar el efecto de un error de medición.
6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, siendo el microorganismo una bacteria patógena responsable de la septicemia.
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