Procedimiento de prueba de ligando LXR.

Un procedimiento de identificación de un agente terapéutico o preventivo que afecta a la concentración de colesterolLDL y/o de triglicéridos en plasma en un mamífero,

comprendiendo el procedimiento:

(i) proporcionar un heterodímero que comprende LXRa y RXRa;

(ii) poner en contacto una sustancia de prueba con el heterodímero en presencia de un coactivador de LXR;

(iii) medir la cantidad de coactivador unido al heterodímero;

(iv) comparar la cantidad de coactivador medida en la etapa (iii) con la cantidad de coactivador unido alheterodímero en un control;

(v) correlacionar la diferencia entre la cantidad de coactivador unido en presencia de la sustancia de prueba y lacantidad de coactivador unido en el control, en el que un aumento en la cantidad de coactivador unido enpresencia de la sustancia de prueba en comparación con el control es indicativo de que la sustancia de pruebatiene el efecto de aumentar la concentración de colesterol LDL y/o de triglicéridos en plasma en un mamífero.

Procedimiento de prueba de ligando LXR

Antecedentes de la invención Descripción de la técnica relacionada Se sabe que los triglicéridos y el colesterol LDL en plasma son factores de riesgo para arteriosclerosis. La hiperlipidemia, en la que concentraciones en sangre de triglicéridos y colesterol LDL son elevadas, es una enfermedad que no solo produce alteración de células endoteliales vasculares, sino que también produce deposición de colesterol sobre las paredes vasculares.

Como el transportador A1 de unión a ATP (ABCA1) tiene una función que elimina el colesterol depositado sobre las paredes vasculares, se cree que aumentar la cantidad expresada de ABCA1 haría posible prevenir la progresión de o mejorar la arteriosclerosis (Bodzioch, M. y col. Nat. Genet., 22, 347-351, 1999) .

El receptor nuclear, el receptor X del hígado (LXR) , controla la transcripción del gen regulador del colesterol y el metabolismo de los lípidos. Como los agonistas de LXR tienen la capacidad de aumentar la expresión de ABCA1, se espera que los agonistas de LXR sean útiles como agentes antiarterioscleróticos novedosos.

Se sabe que LXR tiene dos isoformas que consisten en LXRα y LXRβ. LXRα se expresa altamente en el hígado, intestino, adipocitos y riñón, y solo se expresa ligeramente en las células suprarrenales, musculares y hematopoyéticas. Por otra parte, LXRβ se expresa universalmente ubicuamente.

Cuando se administró un agonista de pan-LXR a ratones naturales, ratones deficientes en LXRα o ratones deficientes en LXRβ, el agonista de pan-LXR elevó los niveles de triglicéridos en plasma en ratones naturales y ratones deficientes en LXRα, mientras que el agonista de pan-LXR no afectó los niveles de triglicéridos en plasma. De estos resultados se ha desvelado un procedimiento para adquirir agonistas selectivos para LXRβ (documento US2003/0073614A1) .

Cuando un ligando se une a un receptor nuclear, la estructura tridimensional del receptor nuclear cambia, y se sabe que estos cambios conformacionales se producen en la unión entre el receptor nuclear y el factor que se asocia a la transcripción, concretamente una proteína co-activadora o co-represora. El tipo de coactivador que se une al receptor

nuclear varía según el tipo de célula y tejido. Además, si el ligando que se une al receptor nuclear se diferencia, entonces el cambio en la estructura tridimensional del receptor nuclear también se diferencia, y como resultado, también se diferencian los tipos y números de coactivadores que se unen al receptor nuclear.

Aunque ejemplos conocidos de proteínas coactivadoras para LXR incluyen PGC-1α (receptor activado por proliferador de peroxisomas de Homo sapiens, gamma, coactivador 1, alfa: Proc Natl Acad Sci USA. 100, 5419-24, 2003) , TIF-2 30 (coactivador 2 de receptor nuclear de Homo sapiens) (EMBO J., 23, 2083-2091, 2004) , ASC-2 (cointegrador 2 de señal activante) (Mol. Cell Biol., 23, 3583-3592, 2003) , SRC-1 (coactivador 1 de receptor esteroide humano) (Arterioscler Thromb. Vasc. Biol., 24, 703-708, 2004) , DAX1 (región crítica de hipoplasia suprarrenal congénita (AHC) de inversión de sexo sensible a la dosificación sobre el cromosoma X, gen 1) (Mol. Endocrinol., 17, 994-1004, 2003) , PNRC (proteína correguladora de receptor nuclear rico en prolina) (Mol. Endocrinol., 14, 986-998, 2000) , TRAP220 (proteína 220 asociada a receptor de la hormona tiroidea) (J. Biol. Chem., 280, 1625-1633, 2005) , PERC (coactivador 1 gamma de receptor activado por proliferador de peroxisomas beta) (J. Biol. Chem., 281, 14537-14546, 2006) , ACTR (coactivador 3 de receptor esteroideo) (J. Biol. Chem., 281, 14787-14795, 2006) , todavía tiene que realizarse investigación sobre ligandos LXR en vista de la interacción entre estos coactivadores y LXR, además de ligandos LXR.

Pelton y col., “Nuclear receptors as potential targets for modulating reverse cholesterol transport” Current Topics in Medicinal Chemistr y , vol. 5, nº 3, 2005, pág 265-281, es una revisión que describe la función de receptores nucleares en la regulación de genes que participan en el transporte de colesterol y moduladores sintéticos de estos receptores. Informa que se ha mostrado que receptores nucleares de la familia de heterodímeros RXR regulan genes clave que participan en el metabolismo de HDL e invierten el transporte de colesterol. Informa adicionalmente que los moduladores de la familia de recetores heterodímeros RXR podrían producir el desarrollo de terapias novedosas 45 altamente eficaces para la prevención y tratamiento de enfermedad aterosclerótica.

Resumen de la invención Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento de identificación de ligandos LXR que no produzcan un efecto, por ejemplo, aumento, en concentraciones de colesterol LDL y/o triglicérido en plasma en un mamífero.

Además, otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento de medir fácilmente los efectos de ligandos LXR sobre lípidos plasmáticos.

Además, otro objeto de la presente invención es proporcionar un kit que pueda usarse para identificar ligandos LXR que no produzcan un efecto, por ejemplo, aumento, en la concentración de colesterol LDL y/o triglicéridos en plasma en un mamífero.

Como resultado de realizar amplios estudios para resolver los problemas anteriormente mencionados, los inventores de la presente invención encontraron que entre agonistas de LXR, ciertos agonistas de LXR tienen la función de aumentar la concentración de colesterol por lipoproteínas de baja densidad (LDL) , y que no se observan ligandos LXR para los que hay baja actividad de unión entre LXRα y un coactivador específico o solo se observa que aumentan ligeramente las concentraciones de triglicéridos en plasma y/o colesterol LDL.

Los inventores de la presente invención también descubrieron un procedimiento de medir fácilmente si un ligando LXR

tiene o no la función de aumentar la concentración de triglicéridos en plasma y/o la concentración de colesterol LDL utilizando la actividad de unión entre LXR y un coactivador.

Además, los inventores de la presente invención descubrieron un procedimiento de identificación de ligandos LXR que no tienen la función de afectar, por ejemplo, aumentar, la concentración de triglicéridos en plasma y/o la concentración de colesterol LDL en un mamífero utilizando la actividad de unión entre LXR y un coactivador, conduciendo así a la completitud de la presente invención.

La presente invención proporciona un procedimiento para medir fácilmente si un ligando LXR tiene o no la función de afectar, por ejemplo, aumentar, la concentración de triglicéridos en plasma y/o la concentración de colesterol LDL en un mamífero.

Además, la presente invención proporciona un procedimiento de identificación de ligandos LXR que no tienen la función de afectar, por ejemplo, aumentar, la concentración de triglicéridos en plasma y/o la concentración de colesterol LDL en un mamífero.

Además, la presente invención proporciona un kit que puede usarse en un procedimiento de identificación de ligandos LXR que no produce un efecto significativo, por ejemplo, aumento, en la concentración de la concentración de colesterol LDL y/o de triglicéridos en plasma en un mamífero.

Estas invenciones son del siguiente modo:

1) Un procedimiento de identificación de un agente terapéutico o preventivo que afecta la concentración de colesterol LDL y/o de triglicéridos en plasma en un mamífero, comprendiendo el procedimiento:

(i) proporcionar un heterodímero que comprende LXRα y RXRα,

(ii) poner en contacto una sustancia de prueba con el heterodímero en presencia de un coactivador de LXR;

(iii) medir la cantidad de coactivador unido al heterodímero;

(iv) comparar la cantidad de coactivador medida en la etapa (iii) con la cantidad de coactivador unido al heterodímero en un control; y

(v) correlacionar la diferencia entre la cantidad de coactivador unido en presencia de la sustancia de prueba y la cantidad de coactivador unido en el control en el que un aumento en la cantidad de coactivador unido en

presencia de la sustancia de prueba en comparación con el control es indicativo de que la sustancia de prueba tiene el efecto de aumentar la concentración de colesterol LDL y/o de triglicéridos en plasma en un mamífero.

2) El procedimiento según 1) , en el que el procedimiento es para identificar un agente terapéutico o preventivo que no produce un aumento en colesterol LDL y/o plasma en un mamífero.

3) El procedimiento según 1) , en el que... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de identificación de un agente terapéutico o preventivo que afecta a la concentración de colesterol LDL y/o de triglicéridos en plasma en un mamífero, comprendiendo el procedimiento:

(i) proporcionar un heterodímero que comprende LXRα y RXRα;

(ii) poner en contacto una sustancia de prueba con el heterodímero en presencia de un coactivador de LXR;

(iii) medir la cantidad de coactivador unido al heterodímero;

(iv) comparar la cantidad de coactivador medida en la etapa (iii) con la cantidad de coactivador unido al heterodímero en un control;

(v) correlacionar la diferencia entre la cantidad de coactivador unido en presencia de la sustancia de prueba y la

cantidad de coactivador unido en el control, en el que un aumento en la cantidad de coactivador unido en presencia de la sustancia de prueba en comparación con el control es indicativo de que la sustancia de prueba tiene el efecto de aumentar la concentración de colesterol LDL y/o de triglicéridos en plasma en un mamífero.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el procedimiento es para identificar un agente terapéutico o preventivo que no produce un aumento en la concentración de colesterol LDL y/o de triglicéridos en plasma en un 15 mamífero.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la sustancia de prueba es un ligando LXR.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el agente terapéutico o preventivo es para tratar o prevenir una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en arteriosclerosis, aterosclerosis, hiperlipidemia, enfermedades relacionadas con los lípidos, enfermedad inflamatoria mediada por citocinas inflamatorias, enfermedades

autoinmunitarias, enfermedad cardiovascular, enfermedad cerebrovascular, enfermedad renal, diabetes mellitus, complicaciones diabéticas, obesidad, nefritis, hepatitis y enfermedad de Alzheimer.

5. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el coactivador está seleccionado del grupo que consiste en PGC-1α (receptor activado por proliferador de peroxisomas de Homo sapiens, coactivador gamma 1, alfa) , TIF-2 (coactivador 2 de receptor nuclear de Homo sapiens) , ASC-2 (cointegrador 2 de señal activante) , SRC-1 (coactivador 1

de receptor esteroide humano) , DAX1 (región crítica de hipoplasia suprarrenal congénita (AHC) de inversión de sexo sensible a la dosificación sobre el cromosoma X, gen 1) , PNRC (proteína correguladora de receptor nuclear rico en prolina) , TRAP220 (proteína 220 asociada a receptor de la hormona tiroidea) , PERC (coactivador 1 gamma de receptor activado por proliferador de peroxisomas beta) y ACTR (coactivador 3 de receptor esteroideo) .

6. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el coactivador es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 16, SEC ID Nº 17, SEC ID Nº 18, SEC ID Nº 19, SEC ID Nº 20, SEC ID Nº 21, SEC ID Nº 22, SEC ID Nº 23, SEC ID Nº 24, SEC ID Nº 25, SEC ID Nº 26, SEC ID Nº 27, SEC ID Nº 28 y variantes de las mismas.

7. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el LXRα es un polipéptido LXRα de longitud completa humano que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2 o una variante de la misma que tiene al menos el 80% de 35 identidad con SEC ID Nº 2, o una proteína fusionada que contiene dicho polipéptido.

8. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el LXRα es un sitio de unión a ligando de LXRα de longitud completa humano que tiene una secuencia de aminoácidos del aminoácido nº 164 a 447 de SEC ID Nº 2 o una variante de la misma que tiene al menos el 80% de identidad con el aminoácido nº 164 a 447 de SEC ID Nº 2, o una proteína fusionada que contiene dicho polipéptido.

9. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el RXRα es un polipéptido RXRα de longitud completa humano que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4 o una variante de la misma que tiene al menos el 80% de identidad con SEC ID Nº 4, o una proteína fusionada que contiene dicho polipéptido.

10. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el RXRα es un sitio de unión a ligando de RXRα de longitud completa humano que tiene una secuencia de aminoácidos del aminoácido nº 201 a 462 de SEC ID Nº 4 o una variante 45 de la misma que tiene al menos el 80% de identidad de aminoácido nº 201 a 462 de SEC ID Nº 4, o una proteína fusionada que contiene dicho polipéptido.

11. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la cantidad de coactivador unido al heterodímero se mide usando un ensayo de FRET.

12. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el LXRα y/o el RXRα se proporciona usando células que

expresan LXRα y/o RXRα.

13. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el LXRα y/o el RXRα se proporciona usando células que expresan LXRα y/o RXRα como proteína exógena.

14. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el LXRα y/o el RXRα se proporciona usando células que 5 expresan LXRα y/o RXRα como proteína endógena.

15. Un kit que se usa para una cualquiera de reivindicaciones 1 a 14, comprendiendo el kit:

un primer polipéptido que comprende un sitio de unión a ligando de un polipéptido LXRα humano que comprende la secuencia de aminoácidos del aminoácido nº 164 a 447 de SEC ID Nº 2 o una variante de la misma que tiene al menos el 80% de identidad con el aminoácido nº 164 a 447 de SEC ID Nº 2; un segundo 10 polipéptido que comprende un sitio de unión a ligando de un polipéptido RXRα de longitud completa humano que comprende la secuencia de aminoácidos del aminoácido nº 201 a 462 de SEC ID Nº 4 o una variante de la misma que tiene al menos el 80% de identidad con el aminoácido nº 201 a 462 de SEC ID Nº 4; y un coactivador seleccionado del grupo que consiste en PGC-1α (receptor activado por proliferador de peroxisomas de Homo sapiens, coactivador gamma 1, alfa) , TIF-2 (coactivador 2 de receptor nuclear de Homo sapiens) ,

ASC-2 (cointegrador 2 de señal activante) , SRC-1 (coactivador 1 de receptor esteroide humano) , DAX1 (región crítica de hipoplasia suprarrenal congénita (AHC) de inversión de sexo sensible a la dosificación sobre el cromosoma X, gen 1) , PNRC (proteína correguladora de receptor nuclear rico en prolina) , TRAP220 (proteína 220 asociada a receptor de la hormona tiroidea) , PERC (coactivador 1 gamma de receptor activado por proliferador de peroxisomas beta) y ACTR (coactivador 3 de receptor esteroideo) .

16. Un kit según la reivindicación 15 en el que el primer polipéptido comprende un polipéptido LXRα de longitud completa humano que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2 o una variante de la misma que tiene al menos el 80% de identidad con SEC ID Nº 2; y el segundo polipéptido comprende un polipéptido RXRα de longitud completa humano que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 4 o una variante de la misma que tiene al menos el 80% de identidad con SEC ID Nº 4, en el que el polipéptido LXRα de longitud completa humano comprende el sitio de unión a ligando del polipéptido LXRα humano y el polipéptido RXRα de longitud completa humano comprende el sitio de unión a ligando del polipéptido RXRα humano.

17. Un kit según la reivindicación 15, en el que el primer y segundo polipéptidos forman juntos un polipéptido fusionado.

18. Un kit que comprende primer y segundo polinucleótidos que codifican el primer y segundo polipéptidos como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, respectivamente; y un coactivador seleccionado del grupo que 30 consiste en PGC-1α (receptor activado por proliferador de peroxisomas de Homo sapiens, coactivador gamma 1, alfa) , TIF-2 (coactivador 2 de receptor nuclear de Homo sapiens) , ASC-2 (cointegrador 2 de señal activante) , SRC-1 (coactivador 1 de receptor esteroide humano) , DAX1 (región crítica de hipoplasia suprarrenal congénita (AHC) de inversión de sexo sensible a la dosificación sobre el cromosoma X, gen 1) , PNRC (proteína correguladora de receptor nuclear rico en prolina) , TRAP220 (proteína 220 asociada a receptor de la hormona tiroidea) , PERC (coactivador 1

gamma de receptor activado por proliferador de peroxisomas beta) y ACTR (coactivador 3 de receptor esteroideo) .

19. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en el que el coactivador es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 16, SEC ID Nº 17, SEC ID Nº 18, SEC ID Nº 19, SEC ID Nº 20, SEC ID Nº 21, SEC ID Nº 22, SEC ID Nº 23, SEC ID Nº 24, SEC ID Nº 25, SEC ID Nº 26, SEC ID Nº 27, SEC ID Nº 28 y variantes de las mismas.

20. Un kit que comprende un vector recombinante que contiene el primer y segundo polinucleótidos como se define en la reivindicación 18 y un coactivador seleccionado del grupo que consiste en PGC-1α (receptor activado por proliferador de peroxisomas de Homo sapiens, coactivador gamma 1, alfa) , TIF-2 (coactivador 2 de receptor nuclear de Homo sapiens) , ASC-2 (cointegrador 2 de señal activante) , SRC-1 (coactivador 1 de receptor esteroide humano) , DAX1 (región crítica de hipoplasia suprarrenal congénita (AHC) de inversión de sexo sensible a la dosificación sobre el

cromosoma X, gen 1) , PNRC (proteína correguladora de receptor nuclear rico en prolina) , TRAP220 (proteína 220 asociada a receptor de la hormona tiroidea) , PERC (coactivador 1 gamma de receptor activado por proliferador de peroxisomas beta) y ACTR (coactivador 3 de receptor esteroideo) .

21. Un kit según la reivindicación 20, en el que el vector recombinante es un vector de expresión.

22. Un kit que comprende células huésped transformadas con un vector recombinante como se define en la

reivindicación 20 ó 21, y un coactivador seleccionado del grupo que consiste en PGC-1α (receptor activado por proliferador de peroxisomas de Homo sapiens, coactivador gamma 1, alfa) , TIF-2 (coactivador 2 de receptor nuclear de Homo sapiens) , ASC-2 (cointegrador 2 de señal activante) , SRC-1 (coactivador 1 de receptor esteroide humano) , DAX1 (región crítica de hipoplasia suprarrenal congénita (AHC) de inversión de sexo sensible a la dosificación sobre el cromosoma X, gen 1) , PNRC (proteína correguladora de receptor nuclear rico en prolina) , TRAP220 (proteína 220 asociada a receptor de la hormona tiroidea) , PERC (coactivador 1 gamma de receptor activado por proliferador de peroxisomas beta) y ACTR (coactivador 3 de receptor esteroideo) .

23. Un kit según la reivindicación 22, en el que las células huésped son células de mamífero.

24. Un procedimiento de detección de un aumento en el nivel de concentración de colesterol LDL y/o de triglicéridos en 5 plasma en un mamífero que comprende:

(i) poner en contacto una muestra biológica recogida de un mamífero con un heterodímero que comprende LXRα y RXRα en presencia de un coactivador de LXR;

(ii) repetir dicha etapa de puesta en contacto (i) con una muestra de control;

(iii) medir la cantidad de coactivador unido al heterodímero;

(iv) comparar la cantidad de coactivador unido al heterodímero en la muestra biológica recogida del mamífero y el coactivador unido al heterodímero en la muestra de control; y

(v) determinar que el mamífero tiene un elevado nivel de concentración de colesterol LDL y/o de triglicéridos en plasma cuando la cantidad de coactivador unido al heterodímero en la muestra biológica es mayor que la cantidad de coactivador unido al heterodímero en el control.

25. Un procedimiento de diagnóstico de un estado de enfermedad en un mamífero que comprende:

(i) poner en contacto una muestra biológica recogida de un mamífero con un heterodímero que comprende LXRα y RXRα en presencia de un coactivador de LXR;

(ii) repetir dicha etapa de puesta en contacto (i) con una muestra de control;

(iii) medir la cantidad de coactivador unido al heterodímero;

(iv) comparar la cantidad de coactivador unido al heterodímero en la muestra biológica recogida del mamífero y el coactivador unido al heterodímero en la muestra de control; y

(v) determinar que el mamífero está en un estado de enfermedad cuando la cantidad de coactivador unido al heterodímero en la muestra biológica es mayor que la cantidad de coactivador unido al heterodímero en el control, que es indicativo de un aumento en el nivel de concentración de colesterol LDL y/o de triglicéridos en plasma en el mamífero, en el que el estado de enfermedad está seleccionado del grupo que consiste en (a) arteriosclerosis, (b) aterosclerosis, (c) hiperlipidemia, (d) una enfermedad relacionada con los lípidos, (e) una enfermedad inflamatoria mediada por una citocina inflamatoria, (f) una enfermedad autoinmunitaria, (g) una enfermedad cardiovascular, (h) una enfermedad cerebrovascular, (i) una enfermedad renal, (j) diabetes mellitus,

(k) una complicación diabética, (l) obesidad, (m) nefritis, (n) hepatitis (o) un tumor, (p) enfermedad de Alzheimer 30 y (q) arteriosclerosis producida por una o más de las enfermedades (c) a (o) .

26. El procedimiento según la reivindicación 24 ó 25, en el que el mamífero es un ser humano.

27. El procedimiento según la reivindicación 26, en el que la muestra biológica es una muestra de sangre.

28. El procedimiento según la reivindicación 27, en el que el coactivador es un coactivador de LXR.

29. El procedimiento según la reivindicación 28, en el que el coactivador está seleccionado del grupo que consiste en

PGC-1α (receptor activado por proliferador de peroxisomas de Homo sapiens, coactivador gamma 1, alfa) , TIF-2 (coactivador 2 de receptor nuclear de Homo sapiens) , ASC-2 (cointegrador 2 de señal activante) , SRC-1 (coactivador 1 de receptor esteroide humano) , DAX1 (región crítica de hipoplasia suprarrenal congénita (AHC) de inversión de sexo sensible a la dosificación sobre el cromosoma X, gen 1) , PNRC (proteína correguladora de receptor nuclear rico en prolina) , TRAP220 (coactivador 1 gamma de receptor asociado a receptor de la hormona tiroidea beta) y ACTR

(coactivador 3 de receptor esteroideo) .