Procedimiento basado en la AFLP para la integración de mapas físicos y genéticos.

Procedimiento para proporcionar un mapa genético y físico integrado de un genoma o parte del mismo,

comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a) proporcionar por lo menos dos marcadores genéticos individuales para el genoma o parte del mismo,preferentemente en forma de mapa genético;

(b) caracterizar cada uno de los marcadores genéticos mediante por lo menos un fragmento de la AFLP identificadomediante la obtención de huellas genéticas de AFLP;

(c) proporcionar una genoteca de clones que comprende fragmentos de genoma o parte del mismo, preferentementeuna genoteca de cromosomas artificiales tales como un BAC o un YAC;

(d) generar una pluralidad de mezclas, conteniendo cada mezcla una pluralidad de clones individuales de lagenoteca;

(e) generar una huella genética AFLP para cada una de las mezclas;

(f) identificar en la pluralidad de mezclas, la(s) mezcla(s) en las que se encuentra presente un fragmento de AFLPidentificado en (b) en la huella genética de la mezcla;

(g) generar una huella genética de AFLP para cada uno de los clones individuales de la(s) mezcla(s) identificada(s)en (f), e identificar el clon que comprende el fragmento de AFLP identificado en (b) en su huella genética de AFLP;

(h) generar un cóntigo que comprenda los clones individuales identificados en la etapa (g) basado en los datos de laobtención de huellas genéticas;

(i) repetir las etapas (f) a (h) para por lo menos un segundo fragmento de AFLP identificado en (b) de tal modo que elsegundo fragmento de AFLP o los fragmentos adicionales de AFLP caracterizan un segundo marcador genético ounos marcadores genéticos adicionales; y

(j) vincular por lo menos dos de los cóntigos obtenidos en (h), obteniendo de este modo una mapa físico y genéticointegrado del genoma o parte del mismo, que comprende por lo menos dos marcadores genéticos;

en el que los pares cebadores de AFLP utilizados en las etapas (b) y (e) presentan una selectividad superior y lospares cebadores de AFLP pares en la etapa (g) presentan una selectividad inferior, comprendiendo cada cebador deAFLP una secuencia constante y una secuencia variable en el extremo 3' de su secuencia, comprendiendo dichasecuencia constante una secuencia de nucleótidos que se puede hibridar con por lo menos una parte del adaptadoradyacente al extremo 3' del fragmento de restricción para amplificarse y comprende además una secuencia denucleótidos que se puede hibridar con los restos del sitio de restricción, comprendiendo dicha secuencia variablenucleótidos selectivos, siendo dichos nucleótidos selectivos complementarios a los nucleótidos del extremo 3' de losfragmentos de restricción ligados al adaptador que se encuentran adyacentes a la secuencia constante, en el quelos cebadores de AFLP de selectividad superior comprenden por lo menos un nucleótido selectivo más que loscebadores de AFLP de selectividad inferior, y en el que los cebadores de AFLP utilizados para caracterizar elmarcador genético en la etapa (g) difieren de los cebadores de AFLP utilizados para obtener huellas genéticas delas mezclas en las etapas (b) y (e) únicamente en el número de nucleótidos selectivos.

Procedimiento basado en la AFLP para la integración de mapas físicos y genéticos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología, más en particular al campo de la cartografía genómica y más en particular al campo de relacionar marcadores físicos y genéticos y al campo de la integración de mapas físicos y genéticos. La presente invención se refiere a un procedimiento para la integración de mapas físicos y genéticos, más en particular a la construcción de mapas genéticos y físicos integrados de alto rendimiento.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los mapas genéticos y físicos integrados resultan muy valiosos para el aislamiento de genes basado en mapas, el análisis comparativo del genoma y como fuentes de clones con la secuencia preparada para proyectos de secuenciación del genoma. El efecto de la disponibilidad de un mapa integrado de marcadores físicos y genéticos de una especie para la investigación del genoma es enorme. Los mapas integrados permiten una cartografía genérica precisa y rápida y cartografiar todos los locus de microsatélites y otras aplicaciones tales como la manipulación genética basada en el marcador SNA. Se han desarrollado diversos procedimientos para realizar mapas físicos de genomas de complejidad diversa. Uno de los enfoques mejor caracterizados utiliza enzimas de restricción para generar grandes cantidades de fragmentos de ADN de subclones genómicos (Brenner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., (1989) , 86, 8902-8906; Gregor y et al., Genome Res. (1997) , 7, 1162-1168; Marra et al., Genome Res. (1997) , 7, 1072-1084) . Dichas huellas genéticas se comparan para identificar clones relacionados y montar clones superpuestos en cóntigos. Sin embargo, la utilidad de la obtención de huellas genéticas para ordenar un genoma complejo es limitada debido a la variación en la migración del ADN de gel a gel, la presencia de secuencias de ADN repetitivo, una distribución inusual de sitios de restricción y representación sesgada de clones. Además, la obtención de huellas genéticas por sí misma, a menos que se combine con otros procedimientos, no relaciona los clones genómicos directamente con los mapas genéticos. Por lo tanto, la mayoría de mapas físicos de alta calidad de genomas complejos se han construido utilizando una combinación entre la obtención de huellas genéticas y procedimientos basados en la PCR o basados en la hibridación.

Se conoce la amplificación de fragmentos de restricción selectiva o AFLP, por ejemplo a partir de la solicitud de patente europea 0 534 858 y la patente US n.º 6.045.994, a nombre del presente solicitante, y de un artículo de investigación de Vos et al. Nucleic Acids Research (1995) , 23, 4407-4414. En general, la AFLP comprende las etapas de:

(a) digerir un ácido nucleico, en particular un ADN o un ADNc, con una o más endonucleasas de restricción específicas, para fragmentar dicho ADN en una serie correspondiente de fragmentos de restricción;

(b) ligar los fragmentos de restricción obtenidos de este modo con por lo menos un adaptador sintético de oligonucleótidos de doble cadena, uno de cuyos extremos es compatible con uno o ambos de los extremos de los fragmentos de restricción, para de este modo producir fragmentos de restricción etiquetados del ADN inicial;

(c) poner en contacto dicho fragmentos de restricción etiquetados en condiciones de hibridación con por lo menos un cebador de oligonucleótidos;

(d) amplificar dichos fragmentos de restricción etiquetados hibridados con dichos cebadores mediante PCR o una técnica similar para provocar una elongación adicional de los cebadores hibridados a lo largo de los fragmentos de restricción del ADN inicial con el que dichos cebadores se hibridan; e

(e) identificar o recuperar el fragmento de ADN amplificado o alargado obtenido de este modo.

A continuación se pueden analizar y visualizar los fragmentos de ADN amplificados obtenidos de este modo, por ejemplo, mediante electroforesis en gel. Ello proporciona una huella genética que presenta bandas específicas correspondientes a los fragmentos de restricción que se han enlazado con el adaptador, los ha reconocido el cebador y, de este modo, se han amplificado durante la etapa de amplificación. La huella genética obtenida de este modo proporciona información sobre la restricción específica, los datos de sitio del ADN inicial y, de este modo, la composición genética del organismo del que se ha obtenido dicho ADN.

La AFLP puede utilizarse para identificar dicho ADN; para analizar la presencia de datos de sitios de restricción específicos, polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP) y/o marcadores genéticos específicos (denominados "marcadores AFLP") , que pueden indicar la presencia de ciertos genes o rasgos genéticos; o para propósitos similares, por ejemplo, comparar los resultados obtenidos con muestras de ADN de origen conocido o datos de restricción, o datos al respecto. La AFLP es sobre todo adecuada para caracterizar marcadores genéticos mediante uno o más fragmentos de la AFLP visualizados de este modo.

Los cebadores utilizados en la AFLP son de tal modo que reconocen el adaptador y puede servir de punto de partida para la reacción en cadena de la polimerasa. Con este objetivo, los cebadores deben presentar una secuencia de nucleótidos que se puede hibridar con (por lo menos una parte de) la secuencia de nucleótidos del adaptador adyacente al extremo 3' del fragmento de restricción a amplificar. Los cebadores pueden comprender asimismo una o más bases adicionales (denominadas "bases selectivas") en el extremo 3' de su secuencia, para hibridarse con cualquier base (s) complementaria (s) en el extremo 3' del fragmento de restricción ligado al adaptador. Dispuesto entre la parte del cebador que se hibrida con el adaptador y las bases selectivas que se hibridan con el fragmento de restricción, el cebador puede comprender una sección que se puede hibridar con los restos del sitio de la restricción. De este modo, en general cebador AFLP presenta la estructura siguiente: el sitio de restricción de la parte complementaria del adaptador continúa siendo bases selectivas complementarias. El sitio de restricción de la parte complementaria del adaptador que continúa complementaria se representa generalmente como la 'secuencia constante' del cebador AFLP y las bases selectivas como la 'secuencia variable'.

Ya que, de todos los fragmentos de restricción ligados al adaptador presentes en la mezcla, únicamente se amplificarán posteriormente aquellos fragmentos que comprendan bases complementarias a las bases selectivas, la utilización de dichos cebadores "selectivos" reducirá la cantidad total de bandas en la huella genética final, por lo que de este modo la huella genética resulta más clara y más específica. Asimismo, la utilización de distintos cebadores selectivos (es decir, distintas secuencias variables) se obtendrán generalmente huellas genéticas distintas, que se pueden utilizar asimismo como herramienta destinada a la identificación o el análisis.

Los nucleótidos selectivos son complementarios a los nucleótidos de los fragmentos de restricción ligados al adaptador que se encuentran adyacentes a la secuencia constante del cebador.

Los cebadores que comprenden nucleótidos selectivos se denominan cebadores +N, representando N el número de nucleótidos selectivos presentes en el extremo 3' del cebador. N se selecciona preferentemente de entre A, C, T o G.

N se puede seleccionar asimismo de entre diversos nucleótidos alternativos, es decir, compuestos que pueden imitar el comportamiento de los nucleótidos ACTG pero que presentan además otras características tales como la capacidad de una hibridación mejorada en comparación con los nucleótidos ACTG o la capacidad de modificar la estabilidad de los bicatenarios resultantes de la hibridación. Los ejemplos de los mismos comprenden ácidos nucleicos peptídicos (PNA) , ácidos nucleicos bloqueados (LNA) , inosina, etc. Cuando se realiza la amplificación con más de un cebador, tal como con una PCR utilizando dos cebadores, uno o ambos cebadores pueden presentar nucleótidos selectivos. El número de nucleótidos selectivos puede variar, dependiendo de la especie o de otros detalles que los expertos en la materia pueden determinar. En general, el número de nucleótidos selectivos no superior 10, pero por lo menos 5, preferentemente 4, más preferentemente 3, más preferido 2 y especialmente preferido es 1 nucleótido selectivo.

De este modo un cebador +1 comprende un nucleótido selectivo, un cebador +2 comprende 2 nucleótidos selectivos, etc. Un cebador sin nucleótidos selectivos (es decir, un... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para proporcionar un mapa genético y físico integrado de un genoma o parte del mismo, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a) proporcionar por lo menos dos marcadores genéticos individuales para el genoma o parte del mismo, preferentemente en forma de mapa genético;

(b) caracterizar cada uno de los marcadores genéticos mediante por lo menos un fragmento de la AFLP identificado mediante la obtención de huellas genéticas de AFLP;

(c) proporcionar una genoteca de clones que comprende fragmentos de genoma o parte del mismo, preferentemente una genoteca de cromosomas artificiales tales como un BAC o un YAC;

(d) generar una pluralidad de mezclas, conteniendo cada mezcla una pluralidad de clones individuales de la genoteca;

(e) generar una huella genética AFLP para cada una de las mezclas;

(f) identificar en la pluralidad de mezclas, la (s) mezcla (s) en las que se encuentra presente un fragmento de AFLP identificado en (b) en la huella genética de la mezcla;

(g) generar una huella genética de AFLP para cada uno de los clones individuales de la (s) mezcla (s) identificada (s) en (f) , e identificar el clon que comprende el fragmento de AFLP identificado en (b) en su huella genética de AFLP;

(h) generar un cóntigo que comprenda los clones individuales identificados en la etapa (g) basado en los datos de la obtención de huellas genéticas;

(i) repetir las etapas (f) a (h) para por lo menos un segundo fragmento de AFLP identificado en (b) de tal modo que el segundo fragmento de AFLP o los fragmentos adicionales de AFLP caracterizan un segundo marcador genético o unos marcadores genéticos adicionales; y

(j) vincular por lo menos dos de los cóntigos obtenidos en (h) , obteniendo de este modo una mapa físico y genético integrado del genoma o parte del mismo, que comprende por lo menos dos marcadores genéticos;

en el que los pares cebadores de AFLP utilizados en las etapas (b) y (e) presentan una selectividad superior y los pares cebadores de AFLP pares en la etapa (g) presentan una selectividad inferior, comprendiendo cada cebador de AFLP una secuencia constante y una secuencia variable en el extremo 3' de su secuencia, comprendiendo dicha secuencia constante una secuencia de nucleótidos que se puede hibridar con por lo menos una parte del adaptador adyacente al extremo 3' del fragmento de restricción para amplificarse y comprende además una secuencia de nucleótidos que se puede hibridar con los restos del sitio de restricción, comprendiendo dicha secuencia variable nucleótidos selectivos, siendo dichos nucleótidos selectivos complementarios a los nucleótidos del extremo 3' de los fragmentos de restricción ligados al adaptador que se encuentran adyacentes a la secuencia constante, en el que los cebadores de AFLP de selectividad superior comprenden por lo menos un nucleótido selectivo más que los cebadores de AFLP de selectividad inferior, y en el que los cebadores de AFLP utilizados para caracterizar el marcador genético en la etapa (g) difieren de los cebadores de AFLP utilizados para obtener huellas genéticas de las mezclas en las etapas (b) y (e) únicamente en el número de nucleótidos selectivos.

2. Procedimiento según de reivindicación 1, en el que las etapas (a) a (g) se repiten para marcadores genéticos adicionales del genoma o parte del mismo y en el que los cóntigos obtenidos en (g) se alinean para obtener de este modo un mapa físico y genético integrado.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la diferencia en el número total de nucleótidos selectivos que se utilizan en los cebadores de AFLP con selectividad inferior en comparación con los cebadores de AFLP con selectividad superior es por lo menos 2, más preferentemente por lo menos 3, más preferentemente por lo menos 4.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el número combinado de nucleótidos selectivos utilizados en los cebadores de AFLP con selectividad baja, es por lo menos 0, preferentemente por lo menos 1, más preferentemente por lo menos 2, más preferentemente por lo menos 3.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que cada mezcla contiene como máximo 0, 6 equivalentes genómicos del genoma total a analizar, preferentemente 0, 5, más preferentemente 0, 4, más preferentemente 0, 3.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además una etapa adicional de agrupación.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que se proporcionan los marcadores genéticos con una densidad de por lo menos un marcador genético por cada 100 kb.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en los cóntigos se alinean mediante un programa informático apto para realizar alineaciones.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la genoteca de cromosomas artificiales contiene por lo menos 5 equivalentes genómicos.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la genoteca de cromosomas artificiales 5 contiene por lo menos 7 equivalentes genómicos.

11. Utilización de unos pares primero y segundo de cebadores de AFLP, comprendiendo dichos cebadores de AFLP una secuencia constante y una secuencia variable en el extremo 3' de su secuencia, comprendiendo dicha secuencia constante una secuencia de nucleótidos que se puede hibridar con por lo menos una parte del adaptador 10 adyacente al extremo 3' del fragmento de restricción para amplificarse y comprende además una secuencia de nucleótidos que se puede hibridar con los restos del sitio de restricción, comprendiendo dicha secuencia variable nucleótidos selectivos, siendo dichos nucleótidos selectivos complementarios a los nucleótidos del extremo 3' de los fragmentos de restricción ligados al adaptador que se encuentran adyacentes a la secuencia constante, en un procedimiento para vincular mapas genómicos genéticos y físicos en los que el primer par de cebadores de AFLP es

de selectividad superior y el segundo par de cebadores de AFLP es de selectividad inferior, comprendiendo los cebadores de AFLP de selectividad superior por lo menos un nucleótido selectivo más que los cebadores de AFLP de selectividad inferior, y en el que los cebadores de AFLP de selectividad inferior difieren de los cebadores de AFLP de selectividad superior únicamente en el número de nucleótidos selectivos.