Presentación en fagos de pVII.

Un genoma de fago o un fagémido que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión quecomprende la proteína de la cubierta menor de fago filamentoso pVII,

en el que la proteína de fusión no comprendeuna secuencia señal N terminal.

Presentación en fagos de pVII

Antecedentes de la invención El uso de enfoques combinatorios para la identificación, caracterización y modificación de proteínas, ha sido altamente exitoso tanto en la investigación como en el desarrollo académico y comercial. A este respecto, la tecnología de presentación en bacteriófagos filamentosos, o fagos, ha preparado el terreno siendo la primera plataforma de colecciones y todavía rige como la tecnología dominante. Por tanto, la presentación en fagos se aplica ampliamente tanto en el descubrimiento de proteínas básico como aplicado, así como en el desarrollo tanto de diagnósticos basados en proteínas novedosos como de tratamientos, ya que son la clase de compuestos que crecen más rápidamente en todo el mundo.

El principio de la tecnología de presentación en fagos se basa en la unión de genotipo - fenotipo ofrecida por la propiedad de que cada virión sólo presentará sobre su superficie las mismas proteínas que se codifican por el genoma encapsulado por su cubierta proteica. La propia partícula de fago es altamente resistente a una variedad de condiciones fisioquímicas; por tanto la presentación en fagos ofrece una versatilidad superior en muchos regímenes de selección en comparación con las tecnologías combinatorias competitivas.

Se ha logrado la presentación en fagos de polipéptidos heterólogos usando las cinco proteínas estructurales de la cubierta de fagos filamentosos, pero sólo la presentación en pIII y en cierta medida en pVIII han alcanzado un uso generalizado (Figura 1) .

Cuando la fusión heteróloga es sólo un péptido corto, se prefieren los sistemas de presentación multivalentes que usan vectores basados en genoma de fago, mientras que para fusiones más grandes que requieren dominios plegados la mayoría de las aplicaciones se beneficiarán de los sistemas fagémidos. En el último caso, la presentación en fagos de pIII-anticuerpo está dominando, con mucho, el campo, pero están emergiendo estructuras alternativas en la actualidad, continuando con la necesidad de expansión de las herramientas de ingeniería de proteínas del futuro. Para muchas aplicaciones, será altamente ventajoso poder fabricar, específicamente y de manera controlada, partículas de fagos biespecíficas en las que más de una de las proteínas de la cubierta presente un péptido de fusión en el contexto de la misma partícula de virus. Además, un sistema de este tipo no debe interferir con los enfoques de presentaciones ya establecidos y en particular con la presentación en pIII y pVIII.

Endemann y Model, 1995 (PMID: 7616570) , informaron de que la proteína de la cubierta menor pVII no estaba accesible en el fago intacto y que pVII no era funcional con otra proteína fusionada a su extremo N-terminal. Por tanto, este informe concluyó que pVII no se puede usar para la presentación en fagos.

Gao et al, 1999 (PMID: 10339535) y la solicitud de patente WO0071694, describen la presentación en fagos de péptidos heterólogos en pVII usando la marca de octapéptido FLAG, así como presentación en fagos simultánea en pVII y pIX para generar polipéptidos heterodiméricos funcionales que albergan topologías de plegado complejo (anticuerpo Fv) . Estos autores quisieron desarrollar un medio alternativo para la presentación de anticuerpos. Las proteínas de fusión pVII y pIX se expresaron a partir de un fagémido empleando una constelación bicistrónica, por lo que las partículas de fagos funcionales resultantes contuvieron inevitablemente varias cantidades de proteínas de 45 fusión pVII y pIX debido a la complementación por la proteína pVII y pIX natural donada desde el genoma del fago colaborador. Como se menciona anteriormente, se había sugerido previamente que pVII y pIX no eran funcionales con otra proteína fusionada a sus extremos N-terminales, y Gao et. al. dieron dos posibles motivos para su éxito, solas o por la combinación de ambas.

Un posible motivo era que una secuencia líder procariota (secuencia señal) se unió de forma N-terminal a las proteínas de fusión, garantizando así la dirección de la proteína recombinante al espacio periplásmico y de este modo evitó la acumulación en el citoplasma. Otro posible motivo era que las proteínas recombinantes se expresaron a partir de un fagémido, no de un genoma de fago como por Endemann y Model, por tanto las pVII y pIX naturales del fago colaborador que necesitaban inevitablemente un rescate de fagémido complementaron las proteínas de 55 fusión pVII y pIX recombinantes, preservando así la funcionalidad natural que de otro modo se podía haber perdido debido a la modificación recombinante. Es decir, los fagos comprenderían una mezcla de proteínas de fusión y naturales. Los autores mencionan que el formato de presentación de pVII-pIX sería particularmente útil para la presentación combinatoria de las matrices heterodímeras, que, por motivos desconocidos, parece proporcionar un enriquecimiento de gran alcance particular durante los protocolos de fijación. Los autores no prevén el uso de pVII como única proteína de presentación (como genoma de fago o fagémido) o el uso de la presentación de pVII en combinación con la presentación de otra proteína de la cubierta (diferente de pIX) para lograr una presentación biespecífica.

Kwasnikowski et al. (PMID: 16277988) describió una fusión genéticamente estable de fragmentos de scFv al gen VII

directamente en el genoma del fago. Es decir, los fagos resultantes no comprendían proteína pVII nativa, y la presentación de pVII era multivalente. Los autores especularon que uno de los motivos para una presentación de pVII exitosa en el formato de genoma de fago es que soportaban el gen de fusión con una secuencia señal procariota que dirige la proteína de fusión al espacio periplásmico. Los autores argumentaron que la única característica de su sistema es que los fagos que presentan pVII llevan la proteína de la cubierta menor pIII natural, no modificada. Puesto que se ha informado de que se requieren múltiples copias de pIII funcional para una infección de células huésped, la presencia de pIII natural de la superficie del fago puede facilitar la recuperación de los anticuerpos seleccionados con mayor diversidad. Por tanto, los autores no prevén la presentación biespecífica, ni prevén la presentación de pVII sin una secuencia señal procariota dirigida al espacio periplásmico.

Khalil et al (PMID: 17360403) describe una aplicación que se aprovecha de la característica de un virión de fago filamentoso biespecífico en el que se presenta un péptido exógeno en cada punta distal del mismo virión. Lograron esto usando la combinación de un vector de genoma de fago pIII común que complementa un fagémido de presentación de pIX. En este ajuste, el vector de genoma de fago sirvió como fago colaborador en el rescate del fagémido, recordando de este modo el enfoque descrito en el presente documento de crear un virión de fagémido biespecífico rescatando un fagémido de presentación de pIII por el uso de un genoma de fago colaborador

modificado pVII. Además, los viriones biespecíficos de Khalil et al presentan una fusión de péptido-pIII que permite una biotinilación controlada de su virión. Sin embargo, existen varias características que diferencian entre estas dos vías de obtención de un virión biespecífico, así como de obtención de una biotinilación de virión definida, lo que las hace únicas entre sí.

El documento WO 2004/050871 divulga una mezcla de proteínas de fusión que contienen dominios de interacción mutua, usados para identificar los agentes de unión específicos donde cada proteína incluye una secuencia de localización para translocación a través de la membrana citoplásmica. La cápside del fago de la mezcla se elige de las cápsides de M13 pIII, pVI, VII y pVIII.

En primer lugar, el enfoque de Khalil et al no se puede usar en combinación con la presentación de fagémido de pIII, ya que el su vector de genoma de fago el que porta su fusión de pIII, por tanto no se puede obtener biespecíficamente en el rescate de fagémido y también sería muy probablemente perjudicial para la funcionalidad de ambas fusiones de pIII.

En segundo lugar, y como también señalaron los propios autores, las modificaciones de pIX genómicas no se consideran como una estrategia viable debido a la superposición de genes en el genoma del fago, por tanto no prevén ni especulan sobre realizar ningún genoma de fago colaborador modificado que se pueda usar para el rescate de fagémido pIII (o pVIII) y de este modo donar una característica fenotípica definida a ambas puntas distales del mismo virión. Khalil et al no mencionan nunca el uso de pVII modificada... [Seguir leyendo]

1. Un genoma de fago o un fagémido que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende la proteína de la cubierta menor de fago filamentoso pVII, en el que la proteína de fusión no comprende 5 una secuencia señal N terminal.

2. El genoma de fago o fagémido de la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión pVII comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en pos. 1-33, 2-33, 3-33, 4-33 y 5-33 de SEQ ID NO:1 (MEQVADFDTIYQAMIQISVVLCFALGIIAGGQR) .

3. El genoma de fago o fagémido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el péptido exógeno de la proteína de fusión pVII está fusionado directamente al extremo N terminal de la secuencia pVII.

4. El genoma de fago o fagémido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el péptido exógeno de la

proteína de fusión pVII se selecciona del grupo que consiste en Avitag (SEQ ID NO:4) , marca FLAG (SEQ ID NO:9) , marca HIS (SEQ ID NO:12) , marca HAT, marca HA, marca c-Myc, marca Strep, marca V5, anticuerpo o fragmento del mismo, receptor de linfocitos T o fragmento del mismo, MHC clase I y II, anquirina, IgNAR o fragmento del mismo, fibronectina o fragmento de la misma, dominio Z de proteína A, CTLA4 o fragmento del mismo, ImmE7 y GFP y otros fluoróforos codificados por genes biológicos.

5. El genoma de fago o fagémido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el péptido exógeno de la proteína de fusión pVII es un miembro de colección.

6. Un fago filamentoso que comprende el genoma de fago o fagémido de cualquiera de las reivindicaciones 25 anteriores.

7. El fago filamentoso de la reivindicación 6, que comprende además un gen que codifica wt pVII y/o la proteína wt pVII.

8. El fago filamentoso de la reivindicación 6, en el que el fago no comprende un gen que codifica wt pVII y/o la proteína wt pVII.

9. El fago filamentoso de cualquiera de las reivindicaciones 6-8, que comprende además una proteína de fusión pIII

o a una proteína de fusión pVIII. 35

10. Una colección de fagos filamentosos como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 6-9 que presenta péptidos exógenos como fusiones para pIII, pVII o pVIII.

11. La colección de la reivindicación 10, en la que los péptidos se presentan de forma simultánea en pVII y pIII o 40 bien pVIII, o ambas.

12. Un sistema de presentación en fagos que comprende un fagémido y un fago colaborador, en el que el fago colaborador comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1.

13. Un sistema de presentación en fagos que comprende un fagémido y un fago colaborador, en el que el fagémido comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1.

14. Un kit que comprende el sistema de presentación en fagos de la reivindicación 12 y/o 13.

Fig. 16