Procedimiento de preparación de ácidos dicafeolquínicos, y su utilización en la lucha contra los pulgones.

Procedimiento de preparación de compuestos de fórmula (I)

en la que

- R representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo,

- R1, R2 y R4 representan, cada uno independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo cafeoil, y

- R3 representa un hidrógeno, un grupo cafeoil o un grupo succinilo,

con la condición de que por lo menos dos de entre R1 a R4 representen un grupo cafeoil, y R3 represente ungrupo succinilo sólo si R2 y R4 representan un grupo cafeoil,

a partir de raíces no tuberizadas, comprendiendo las etapas siguientes:

a) recogida de las raíces no tuberizadas o recuperación del exudado radicular,

b) extracción por uno o varios disolventes orgánicos de los compuestos fenólicos,

c) recuperación del extracto bruto,

d) purificación eventual de dicho extracto obtenido en la etapa c),

e) opcionalmente, isomerización espontánea de dicho extracto en condición de pH alcalino,estando dichos compuestos de fórmula (I) en forma de regio- o esteroisómeros, o sus mezclas, procediendo lasraíces no tuberizadas de plantas del género Ipomoea (convolvuláceas) o de los géneros de la misma familiaArgyreia, Calycobolus, Calystegia, Convolvulus, Dichondra, Erycibe, Evolvulus, Iseia, Jacquemontia, Maripa,Merremia, Mina, Operculina, Porana, Stictocardia, o Turbina.

Procedimiento de preparación de ácidos dicafeolquínicos, y su utilización en la lucha contra los pulgones.

La presente invención tiene por objeto la preparación del ácido 3, 5-dicafeoilquínico, y de algunos de sus derivados, y su utilización en la preparación de productos fitosanitarios.

El ácido 3, 5-dicafeolquínico (3, 5-diCQ) y sus diferentes derivados se han identificado en numerosas especies de interés agronómico que pertenecen a diferentes familias botánicas (rosáceas, entre ellas los árboles frutales de pepitas y de hueso; solanáceas, entre ellas el tomate y la patata; asteráceas, entre ellas el girasol, la alcachofa y la lechuga; rubiáceas, incluyendo el café; convolvuláceas, entre ellas la batata, etc.) .

Varios centenares de publicaciones describen la presencia de estas sustancias en estas diferentes especies y ponen en evidencia sus propiedades químicas y biológicas.

Estos compuestos presentan una fuerte actividad antioxidante, que les confiere un gran interés desde un punto de vista nutricional (Ohnishi et al., (1994) Phytochemistr y , 36: 579-583; Iwai et al., (2004) Journal of Agricultural and Food Chemistr y , 52: 4893-4898; Kim & Lee, (2005) Planta Medica, 71: 871-876; Saito et al.; (2005) Bioorganic & Medicinal Chemistr y , 13: 4191-4199) .

Muestran también múltiples propiedades medicinales, entre otras, como analgésicos (dos Santos et al., (2005) Journal of Ethnopharmacology 96: 545-549) , antihipertensivos (Mishima et al., (2005a) Biological & Pharmaceutical Bulletin 28: 1909-1914) , hipouricemiantes (Nguyen et al., (2005) Biological & Pharmaceutical Bulletin 28: 22312234) , hepatoprotectores (Basnet et al., (1996) Biol Pharm Bull 19: 1479-1484) , antiinflamatorios (Peluso et al., (1995) Journal of Natural Products 58: 639-646) y anticancerosos (Mishima et al., (2005b) Bioorganic & Medicinal Chemistr y 13: 5814-5818) .

Estos compuestos están presentes en preparaciones utilizadas en medicina tradicional, en extractos vegetales actualmente comercializados (extractos a base de alcachofa o de equinácea) y en el própolis (Mishima et al., (2005a) Biological & Pharmaceutical Bulletin 28: 1909-1914; Mishima et al., (2005b) Bioorganic & Medicinal Chemistr y 13: 5814-5818; Basnet et al., (1996) Biol Pharm Bull 19: 1479-1484) . Poseen también importantes propiedades anti-infecciosas, en particular antivirales. Constituyen una nueva clase de antirretrovirus, en particular para el tratamiento del SIDA, por su acción inhibidora sobre la integrasa del VIH (Mahmood et al., (1993) Antiviral Chem. Chemother. 4: 235-240; Mc Dougall et al., (1998) Antimicrobial Agents & Chemotherapy 42: 140-146; Zhu et al., (1999) J Virol 73: 3309-3316) .

La patente EP1008344 describe la utilización de este grupo de moléculas en el tratamiento de la hepatitis B, la solicitud internacional WO2006127525 describe su utilización en el tratamiento del sida, la solicitud japonesa JP2006213636 recomienda la utilización de este grupo de moléculas en el tratamiento de cánceres, la solicitud EP0577516 describe composiciones dermatológicas despigmentantes que los contienen y la solicitud EP1312373 evoca sus efectos anti-alérgicos.

Las propiedades fungicidas de estas moléculas han sido también frecuentemente mostradas (Bazzalo et al., (1985) Phytopathologische Zeitschrift 112: 322-332; Kodoma et al., (1998) Phytochemistr y 47: 371-373; Stange et al., (2001) Postharvest Biology & Technology 23: 85-92) .

Sin embargo, las propiedades insecticidas han sido mucho más raramente estudiadas y los resultados son muy discordantes. Aunque algunos autores han establecido una correlación entre el contenido elevado en diCQ de las raíces de cultivos de lechuga y su resistencia a un pulgón (Pemphigus bursarius) , no han mostrado nunca la actividad biológica directa de estas moléculas con respecto al insecto (Cole et al. (1984) Annals of Applied Biology

105: 129-145) . Otros autores han mostrado que algunos derivados presentaban poca o ninguna actividad insecticida en los insectos masticadores (Beninger et al., (2004) J Chem Ecol 30: 589-605; Schwarz et al. 1996) . Algunos autores han mostrado incluso un efecto fagoestimulante de 3, 5-diCQ sobre los insectos masticadores (Tamura et al. (2004) ; Mullin et al. (1991) .

El melocotonero Prunus persica (L.) Batsch (Rosáceas) , árbol particularmente bien adaptado al clima mediterráneo, es principalmente cultivado en China, en América del Norte (California) , en América del Sur (Chile y Argentina) y en Europa en los países que bordean la cuenca del Mediterráneo, donde los principales centros de cultivo son España, Italia, Grecia y Francia. En 2004, la producción mundial de melocotones era de 15, 6 millones de toneladas, repartidas en una superficie de 1, 4 millones de hectáreas. La producción francesa este mismo año era de 413.000 toneladas producidas principalmente a lo largo del Valle del Ródano, en Provenza, en el Rosellón y a lo largo del Valle de la Garona. Este cultivo representa para estas regiones meridionales una apuesta económica indiscutible.

Sin embargo, el melocotonero puede ser el objetivo de numerosos ataques parasitarios de origen animal o microbiano. Los principales patógenos y plagas cuyo hospedante es el melocotonero son los hongos: el oídio (Sphaerotheca pannosa) , la herrumbre (Taphrina deformans) y la moniliosis (Monilinia laxa, M fructigena y M

fructicola) ; las bacterias que pueden provocar un debilitamiento (Xanthomonas arboricola pathovar pruni) y numerosos insectos y virus.

Un ataque particularmente preocupante es el del pulgón verde del melocotonero, Myzus persicae (Sulzer) . Este insecto picador chupador es particularmente nocivo, no sólo por los daños directos que ocasiona, sino también porque es un vector potencial del Plum Pox Virus, agente que causa la enfermedad de la Sharka, que provoca deformaciones así como decoloraciones de los frutos, haciéndolos entonces no comercializables. Al no haber disponible ningún medio de lucha curativo, los árboles infectados deben ser arrancados.

Para luchar contra este parásito, el agricultor se encuentra entonces enfrentado a dos problemas:

- la lucha química contra el pulgón verde, que exige unos insecticidas potentes (frecuentemente nocivos y tóxicos) y cuya eficacia es por otra parte aleatoria, que conlleva un riesgo de aparición de resistencia al Myzus persicae (Guillemaud et al., (2003) Bulletin of Entomological Research 93, 289-297) , y

- la consideración de la preocupación medioambiental, que pretende por otra parte reducir los inputs fitosanitarios.

Esta problemática ha llevado a genetistas y entomologistas a buscar mejorar la resistencia del melocotonero frente a Myzus persicae.

El pulgón verde del melocotonero pertenece al orden de los Hemípteros y a la familia de las Aphididae. Mide de 1, 2 a 2, 5 mm de largo. Es un pulgón fitófago que se alimenta de savia elaborada, extraída a nivel del floema por unas piezas bucales de tipo picador-chupador (Huilé et al., (1998) en ACTA y INRA ediciones, 77 paginas) .

El ciclo anual de Myzus persicae, bajo un clima templado, se compone de una fase de reproducción sexuada, que conduce a la puesta de un huevo de invierno diapausante, seguida de una fase de reproducción partenogenética (ciclo completo u holocíclico) . Estas dos fases tienen lugar en plantas hospedantes diferentes (ciclo diócico) , denominadas respectivamente hospedante primario (el melocotonero) y hospedante secundario (plantas herbáceas, de las cuales algunas tienen una importancia económica mayor: patata, col, berenjena, remolacha, etc.) .

Los huevos de invierno puestos en la base de las yemas de melocotonero eclosionan desde final de enero hasta final de abril, durante el brote y dan hembras partenogenéticas ápteras, las fundadoras. Estas fundadoras son el origen de varias generaciones de hembras partenogenéticas, las fondatrigenes sobre el hospedante primario. A partir del final de la primavera y en verano, cuando hay sobrepoblación sobre el melocotonero, las fondatrigenes dan origen a individuos alados que colonizan su hospedante secundario. Estos individuos alados engendrarán por reproducción asexuada varias generaciones de ápteros o de alados, los virginogénes, que en otoño darán individuos machos y hembras sexuados y alados, los sexupares. Estos individuos volverán sobre el melocotonero para poner los huevos de invierno (Huilé et al., (1998) ya citado; Sauge, (1999) Analyse des mécanismes de résistance du pêcher Prunus persica (L.) Batsch au puceron vert Thèse Université Pierre et Marie Curie (Paris 6) 188 páginas) .

Los daños directos causados por este pulgón se deben a las picaduras... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de preparación de compuestos de fórmula (I)

en la que

-R representa un átomo de hidrógeno o un grupo metilo, 10

-R1, R2 y R4 representan, cada uno independientemente entre sí, un átomo de hidrógeno o un grupo cafeoil, y

-R3 representa un hidrógeno, un grupo cafeoil o un grupo succinilo, 15 con la condición de que por lo menos dos de entre R1 a R4 representen un grupo cafeoil, y R3 represente un grupo succinilo sólo si R2 y R4 representan un grupo cafeoil, a partir de raíces no tuberizadas, comprendiendo las etapas siguientes:

a) recogida de las raíces no tuberizadas o recuperación del exudado radicular, b) extracción por uno o varios disolventes orgánicos de los compuestos fenólicos, c) recuperación del extracto bruto,

d) purificación eventual de dicho extracto obtenido en la etapa c) , e) opcionalmente, isomerización espontánea de dicho extracto en condición de pH alcalino,

estando dichos compuestos de fórmula (I) en forma de regio- o esteroisómeros, o sus mezclas, procediendo las raíces no tuberizadas de plantas del género Ipomoea (convolvuláceas) o de los géneros de la misma familia Argyreia, Calycobolus, Calystegia, Convolvulus, Dichondra, Er y cibe, Evolvulus, Iseia, Jacquemontia, Maripa, Merremia, Mina, Operculina, Porana, Stictocardia, o Turbina.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque las raíces no tuberizadas proceden de plantas seleccionadas de entre el grupo que comprende la batata (Ipomea batatas) , la volubilis (Ipomoea purpurea) , la enredadera de agua (Ipomoea aquatica) , la volubilis de los jardines (Ipomea indica) , la Ipomea Scarlett O'Hara (Ipomoea nil) y la enredadera de los setos (Calystegia sepium)

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque las raíces no tuberizadas proceden de Ipomea batatas.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las raíces no tuberizadas son producidas por acodadura, esquejado o sembrado. 45

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se producen unas raíces no tuberizadas por cultivo en un medio líquido, a la luz y en situación de carencia mineral.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el compuesto de

fórmula (I) se selecciona de entre las diferentes formas isómeras de los ácidos dicafeoilquínicos, los análogos triacilados, sus análogos metilados, el ácido 4-succinil-3, 5-dicafeoilquínico o sus mezclas.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque los isómeros de los ácidos dicafeoilquínicos se seleccionan de entre el ácido 3, 5-dicafeoilquínico (3, 5-diCQ) , la cinarina (1, 3-diCQ) , el ácido 1, 5-dicafeoilquínico 55 (1, 5-diCQ) , el ácido 3, 4-dicafeoilquínico (3, 4-diCQ) y el ácido 4, 5-dicafeoilquínico (4, 5-diCQ) .

8. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque el análogo triacilado de los ácidos dicafeoilquínicos es el ácido 3, 4, 5-tricafeoilquínico (3, 4, 5-triCQ) .

9. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque los análogos metilados de los ácidos dicafeoilquínicos se seleccionan de entre el 3, 5-dicafeoilquinato de metilo, el 3, 4-dicafeoilquinato de metilo, el 4, 5dicafeoilquinato de metilo.

10. Procedimiento de preparación de un compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 5 anteriores, que comprende además las etapas siguientes:

a) recogida de las raíces no tuberizadas procedentes de tubérculos, esquejes, siembras o acodos,

b) congelación en nitrógeno líquido de las raíces recogidas en la etapa a) , 10 c) liofilización de las raíces congeladas en la etapa b) ,

d) trituración en nitrógeno líquido de las raíces liofilizadas y después, liofilización para obtener un polvo seco,

e) extracción de los compuestos fenólicos por un disolvente orgánico en 1 a 4 veces, por agitación en frío,

f) aclarado del último residuo de la etapa e) por el mismo disolvente orgánico que el utilizado en la etapa e) y después, evaporación del disolvente presente en el extracto hasta la obtención de una fase acuosa,

g) opcionalmente, extracción líquido/líquido volumen a volumen por un disolvente apolar, mediante varias extracciones sucesivas después de la adición de una sal y de un ácido en la fase acuosa,

h) concentración en seco de la fase acuosa obtenida en la etapa f) o de la fase orgánica obtenida en la etapa opcional g) después de la adición de un agente de secado para eliminar el agua residual y filtración, y a 25 continuación, recogida del residuo seco por un disolvente orgánico,

i) separación por CLHP semi-preparativa en fase inversa y recogida de la fracción que contiene el 3, 5-diCQ,

j) concentración en evaporador rotativo de la fracción obtenida en la etapa i) hasta la obtención de una fase 30 acuosa,

k) extracción líquido/líquido por un disolvente orgánico (volumen a volumen) mediante varias extracciones sucesivas después de la adición de una sal, en la fase acuosa para facilitar la extracción en el disolvente apolar de 3, 5-diCQ,

l) concentración en seco de la fase orgánica, después de la adición de un agente de secado, y filtración para eliminar el agua residual, y recogida por un disolvente orgánico,

m) precipitación en frío de la molécula por adición de agua (por lo menos 3 volúmenes para 1 volumen de 40 disolvente orgánico utilizado en la etapa anterior) , congelación del extracto en nitrógeno líquido y liofilización para obtener la molécula en forma de polvo seco.

11. Procedimiento de preparación de un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 10, caracterizado porque la etapa g) se realiza por extracción, bien mediante acetato de etilo o bien mediante dietiléter (volumen a volumen)

después de la adición de NaCl o de sulfato de amonio y de ácido metafosfórico en la fase acuosa, y la etapa k) se realiza mediante extracción, bien por acetato de etilo o bien por dietiléter (volumen a volumen) después de la adición de NaCl o de sulfato de amonio en la fase acuosa.