Combinación de marcadores de células aviarias.

Combinación de marcadores que permite caracterizar unas células aviarias de tipo StX (blastodermo de fase X) ounas células madre aviarias,

que comprende por lo menos dos marcadores, caracterizada porque uno de losmarcadores es específico del gen 1p06 y el otro marcador se selecciona de entre:

a. un marcador de un gen diana expresado preferentemente en las células StX seleccionado de entre los genessiguientes: 2contig58, 60S-L14, ATM, Síndrome de Bloom, Bteb4, CD9, CHD Helicasa, Clock, Cwf16(FLJ10374), CXCR4, Dnmt2, Enx1 (Ho-zeste 2), Eomes, EWS, Fgf4, Gata55, Hoj1, N-AGN6P desacetilasa,N-Cor1, NF2, p53, Pml, Rbm6, Sa2, Sa3, Sara, Scye1, Sef, S1, SnoN, Socs13, Ssb1, TC87479, APP 2C delinfocitos T, TGF-beta2, WD40/FYVE-D proteína 2, WD-RP3, Zan75, Zpc, o

b. un marcador de un gen diana expresado preferentemente en las células madre seleccionado de entre losgenes siguientes: 1P08-A09, Activina RIIB. Astacina, Claudina3, Dapper1, Dorfina, FPP sintasa (Fps),GalNAc-T3, Gcnf, Hspb7, Irx4, Lmx, Pax6, Slc38a2, Sox3, Ttralgp96, Wnt10a, Wwnt11.

Combinación de marcadores de células aviarias.

La presente invención se refiere a una nueva combinación de marcadores de células aviarias que permiten caracterizar dichas células según su fenotipo, ya se trate de células StX o de células madre. La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento de caracterización de células aviarias con dichos marcadores, así como a un procedimiento de cultivo de células aviarias, en el que se caracterizan las células mediante el procedimiento según la invención.

El objetivo de la invención es identificar y utilizar una combinación única de genes susceptibles de ser utilizados como marcadores para definir, modificar, controlar de manera positiva o negativa la competencia germinal de una célula madre aviar de cualquier naturaleza embrionaria, germinal o adulta que sea.

Una célula madre es una célula pluripotente o multipotente de origen embrionario o adulto, que presenta una capacidad de auto-renovación y que es capaz de dar unas células diferenciadas especializadas. En otras palabras, una célula madre es una célula no cancerosa capaz de dividirse indefinidamente en cultivo y de dar una célula hija que presenta la misma capacidad de proliferación y de diferenciación que la célula madre de la cual procede.

Diferentes clases de células madre se han aislado según su origen embrionario o adulto y su origen tisular somático o germinal. Se ha mostrado que las células cepas embrionarias de ratones (MESC) eran capaces de contribuir al linaje germinal cuando eran reintroducidas en un embrión. Los mecanismos moleculares que controlan esta competencia germinal no están completamente identificados.

Las células madre son unas células que tienen la prodigiosa propiedad de auto-renovarse al mismo tiempo in vivo, en el que aseguran el mantenimiento y la renovación de los tejidos, e in vitro, en el que pueden ser mantenidas con unas condiciones definidas de cultivo.

En función de su origen tisular y de su potencialidad de diferenciación, se distinguen las células madre embrionarias (ESC) , células pluripotentes de origen embrionario, las células madre germinales (EGC) y las células madre somáticas o adultas de origen tisular (ASC) . Estas últimas presentan una cierta plasticidad en su potencialidad de diferenciación al mismo tiempo in vitro e in vivo.

Células madre embrionarias (ESC)

Células MESC

Las células madre embrionarias (células ESC) se han aislado e identificado en el ratón en los años 80 (Martin, 1981; Evans & Kaufman., 1981) y su aislamiento está inscrito en la continuidad de los numerosos estudios realizados antes con las células de carcinoma embrionario (o células EC) (para revisión, Chambers & Smith, 2004) . Estas células ESC de ratón (MESC) se han obtenido a partir de la puesta en cultivo in vitro de blastocitos de ratones 129/SV según diferentes protocolos descritos (Robertson, 1987, Hogan et al., 1994) . Los blastocitos de ratones antes de la gastrulación presentan una masa celular interna o ICM de 50 a 100 células, cuya caracterización molecular está todavía en curso. El devenir de estas células no es idéntico in vivo e in vitro.

In vivo, las células del epiblasto darán los tejidos embrionarios, y las células germinales se forman en el epiblasto proximal bajo la inducción de la ectodermis extra-embrionaria. Las células germinales aparecen así dentro de un nicho bajo la influencia de diferentes factores y citoquinas. Los mecanismos moleculares complejos responsables de esta inducción apenas empiezan a ser identificados en el ratón (Saitou et al., 2003) .

In vitro, la puesta en cultivo de los blastocitos conduce a la eclosión de éste, a la adhesión y a la proliferación de las células de la ICM que, en condiciones de cultivo apropiadas, dan lugar a las células MESC. Estas condiciones de cultivo in vitro están, a partir de entonces, relativamente bien identificadas y estandarizadas, en particular por la adición en el medio de cultivo de por lo menos una citoquina de la familia del LIF (Yoshida et al., 1994) . Nuevas vías de señalización parecen estar implicadas también en el mantenimiento del fenotipo de pluripotencia de las células MESC (Dani et al., 1998) . Se han publicado numerosos trabajos sobre los mecanismos moleculares que controlan la pluripotencia de las células MESC. En este modelo, diferentes enfoques moleculares y funcionales han permitido poner en evidencia el papel clave de los genes oct-3/4 (Niwa et al., 2000; Niwa et al., 2002) , nanog (Chambers et al., 2003; Mitsui et al., 2003) y stat3 (Niwa et al., 1998; Matsuda et al., 1999) . Un esquema de consenso coloca el LIF y el BMP en el centro de la señal mitótica, y los genes Oct/nanog y stat3 como reguladores y efectores del equilibrio proliferación-diferenciación de las células ES (Ying et al., 2003; Chambers et al., 2004) . Uno de los efectores aguas abajo sería el proto-oncogén c-myc directamente regulado por STAT3 (Cartwright et al., 2005) . Están implicados otros actores, como la proteína P53 que parece controlar el nivel de expresión de nanog (Lin et al., 2005) . La proteína OCT-3/4 controlaría su transcripción a nivel de su propio promotor en asociación con unas proteínas de la familia de los HMG como SOX-2 y/o SOX-3 (Okomura et al., 2005) . En particular, la restricción de la expresión del gen Oct-3/4 en el linaje germinal del ratón estaría bajo la acción represiva del GCNF (Furhmann et al., 2001) . El receptor Irh-1 estaría implicado por su parte en el mantenimiento en una fase más precoz del desarrollo, como en las células del epiblasto (Gu et al., 2005) . Por lo menos en el ratón, una competencia germinal parece por lo tanto requerir, entre otros, un fuerte nivel de GCNF y un nivel relativamente bajo de OCT-3/4, incluso si la expresión de este gen oct-3/4 es indispensable para el linaje germinal (Kehler et al.; 2004) . La existencia de numerosas interacciones entre unos actores de diferentes redes de señalización es una realidad que no está todavía completamente formulada para comprender el mantenimiento de la pluripotencia de las células MESC.

Se observará que el éxito del establecimiento de las células MESC depende asimismo de la cepa de ratones utilizada, con una facilidad de establecimiento a partir del fondo genético 129SV. La identificación molecular de esta limitación no ha sido documentada.

Células PESC y HESC

A nivel de los primates, las primeras células ESC de simio (PESC) fueron aisladas por J. Thomson de la universidad de Madison (WS) (Thomson et al., 1995) a partir de blastocistos. Desde entonces, otros laboratorios han aislado nuevos linajes de células de simio a partir de diferentes especies. La caracterización de estas células ha sido también el objeto de numerosas publicaciones al mismo tiempo a nivel de los caracteres bioquímicos (AP, telomerasa, antígenos de superficie, etc.) y a nivel de los genes implicados en el mantenimiento de la pluripotencia.

A nivel humano, se han obtenido unas células ESC (HESC) in vitro a partir de la puesta en cultivo de blastocistos (Thomson et al., 1998) . Estas células presentan numerosas similitudes con las células MESC, pero también grandes diferencias como unas sensibilidades a factores de crecimiento diferentes.

A nivel de los mecanismos implicados en el mantenimiento de la pluripotencia de las células PESC y HESC, los genes identificados en el ratón parecen también implicados, pero la situación parece más compleja. A título de ejemplo, la sensibilidad de las células PESC y HESC al LIF y la activación de la vía Jak/stat no parecen ser tan críticas como las de las células murinas (Raz et al., 1999; Sumi et al., 2004; Humphrey et al., 2004) . Estas células no son así exclusivamente dependientes de esta única citoquina, lo cual hace el análisis de la señal de proliferación más complejo. Incluso si se encuentra la expresión de los actores principales oct-3/4, nanog y stat3, así como otros como rex1, foxD3, etc. en las células ESC de primates, el papel de estos genes no podría no ser tan determinante y se considera la existencia de vías alternativas.

Células CESC

Las células madre embrionarias de pollo (CESC) se han aislado mediante la puesta en cultivo de células de blastodermo de pollo en la etapa X (Pain et al., 1996; solicitud de patente n° FR94/12 598) . Estas células CESC presentan todas las características de células madre embrionarias (ESC) , incluida la colonización somática y germinal. Sin embargo, esta colonización germinal parece difícil de mantener después de algunos pasos por cultivo in vitro, al contrario que las células ES murinas. En la etapa de extracción y de puesta en cultivo de las células CES, el embrión... [Seguir leyendo]

1. Combinación de marcadores que permite caracterizar unas células aviarias de tipo StX (blastodermo de fase X) o unas células madre aviarias, que comprende por lo menos dos marcadores, caracterizada porque uno de los marcadores es específico del gen 1p06 y el otro marcador se selecciona de entre:

a. un marcador de un gen diana expresado preferentemente en las células StX seleccionado de entre los genes siguientes: 2contig58.

60. L14, ATM, Síndrome de Bloom, Bteb4, CD9, CHD Helicasa, Clock, Cwf16 (FLJ10374) , CXCR4, Dnmt2, Enx1 (Ho-zeste 2) , Eomes, EWS, Fgf4, Gata55, Hoj1, N-AGN6P desacetilasa, N-Cor1, NF2, p53, Pml, Rbm6, Sa2, Sa3, Sara, Scye1, Sef, S1, SnoN, Socs13, Ssb1, TC87479, APP 2C de linfocitos T, TGF-beta2, WD40/FYVE-D proteína 2, WD-RP3, Zan75, Zpc, o

b. un marcador de un gen diana expresado preferentemente en las células madre seleccionado de entre los genes siguientes: 1P08-A09, Activina RIIB. Astacina, Claudina3, Dapper1, Dorfina, FPP sintasa (Fps) , GalNAc-T3, Gcnf, Hspb7, Irx4, Lmx, Pax6, Slc38a2, Sox3, Ttralgp96, Wnt10a, Wwnt11.

2. Combinación según la reivindicación 1, caracterizada porque el otro marcador de un gen diana expresado preferentemente en las células StX (de blastodermo de fase X) se selecciona de entre los marcadores de los genes siguientes: Atm, CXCR4, Eomes, Fgf4, Gata5, N-AGN6P desacetilasa, NF2, Socs13, Sssbl, TC87479, APP 2C de linfocitos T, TGF-beta2, WD-RP3, ZPC, y sus combinaciones.

3. Combinación según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque comprende por lo menos un marcador del gen 1p06 y un marcador del gen ZPC.

4. Combinación según la reivindicación 1, caracterizada porque el otro marcador de un gen diana expresado preferentemente en las células madre se selecciona de entre los marcadores de los genes siguientes: Activina RIIB, Aastacina, Claudina3, Dapper1, FPP sintasa (Fps) , GalNAc-T3, Gcnf, Lmx, Pax, Ttral gp96, Wnt10a y sus combinaciones.

5. Combinación según la reivindicación 4, caracterizada porque comprende por lo menos un marcador del gen 1P06 y un marcador del gen Tra1.

6. Combinación según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque los marcadores se seleccionan de entre los anticuerpos que se unirán de manera específica a los productos de expresión de un gen diana, ARNm, ADNc o polipéptido, o un fragmento de estos últimos, y los fragmentos de ácido nucleico capaces de hibridarse de manera específica a los ARNm expresados por dichos genes diana o a los ADNc correspondientes, o unos fragmentos de estos últimos.

7. Combinación según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque está ensamblada sobre un mismo soporte, preferentemente un soporte normalizado.

8. Combinación según la reivindicación 7, caracterizada porque se presenta en forma de una matriz de ADN, que comprende un soporte sobre el cual están dispuestos, preferentemente de manera normalizada, los fragmentos de ácido nucleico susceptibles de hibridarse con los genes diana.

9. Combinación según la reivindicación 8, caracterizada porque está dispuesta sobre un chip de ADN.

10. Chip de ADN, caracterizado porque comprende una combinación de marcadores según una de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Procedimiento de caracterización de una célula aviar que comprende las etapas siguientes:

- el análisis de la expresión de los genes expresados en dicha célula, comparando los niveles relativos de expresión de por lo menos dos marcadores, siendo uno específico del gen 1P06 y siendo el otro seleccionado de entre:

a. un marcador de un gen diana expresado preferentemente en las células StX seleccionado de entre los genes siguientes: 2contig58.

60. L14, ATM, Síndrome de Bloom, Bteb4, CD9, CHD Helicasa, Clock, Cwf16 (FLJ10374) , CXCR4, Dnmt2, Enx1 (Ho-zeste 2) , Eomes, EWS, Fgf4, Gata55, Hoj1, N-AGN6P desacetilasa, N-Cor1, NF2, p53, Pml, Rbm6, Sa2, Sa3, Sara, Scye1, Sef, S1, SnoN, Socs13, Ssb1, TC87479, APP 2C de linfocitos T, TGF-beta2, WD40/FYVE-D proteína 2, WD-RP3, Zan75, Zpc, o

b. un marcador de un gen diana expresado preferentemente en las células madre seleccionado de entre los genes siguientes: 1P08-A09, Activina RIIB. Astacina, Claudina3, Dapper1, Dorfina, FPP sintasa (Fps) , GalNAc-T3, Gcnf, Hspb7, Irx4, Lmx, Pax6, Slc38a2, Sox3, Ttralgp96, Wnt10a, Wwnt11.

- la caracterización del fenotipo de las células analizadas entre los dos tipos siguientes: células aviarias de tipo StX o células madre aviarias.

12. Procedimiento de cultivo de células aviarias que comprende el cultivo de células StX o de células madre aviarias previamente caracterizadas por medio de un procedimiento según la reivindicación 11 y aisladas, en un medio de cultivo apropiado.

13. Procedimiento de obtención de células germinales aviarias, caracterizado porque comprende una etapa de cultivo de células StX obtenidas según la reivindicación 12, en un medio de cultivo apropiado sin adición de capa alimentadora quot;feederquot; inactivada.