Procedimiento de producción de líneas restauradoras doble cero de Brassica napus con un buen valor agronómico.
Procedimiento de producción de líneas restauradoras doble cero de Brassica napus para la esterilidad masculinacitoplásmica (emc) Ogura que presentan introgresión de rábano portadora del gen restaurador Rfo suprimido delalelo Pgi-2 de rábano y recombinado con el gen Pgi-2 de Brassica oleracea,
y que presentan un buen valoragronómico caracterizado por la fertilidad femenina, una buena tasa de transmisión de Rfo y un vigor vegetativoelevado, incluyendo dicho procedimiento las etapas siguientes:
a) cruzar las líneas emc doble cero de Brassica napus de primavera que comprenden una inserción suprimidade rábano en cada lado de Rfo, habiendo perdido dichas líneas emc doble cero de Brassica napus deprimavera la expresión de isoenzima del alelo Pgi-2 del genoma del rábano y del alelo Pgi-2 del genoma deB. oleracea, con la línea doble cero de Drakkar de primavera para formar plantas restauradas heterocigóticasde Brassica napus,
b) irradiar antes de la meiosis las plantas restauradas heterocigóticas obtenidas en la etapa a) con irradiación derayos gamma,
c) cruzar el polen de las flores obtenidas en la etapa b) con la línea de Wesroona de primavera emc doble cero,d) someter a prueba la descendencia para el vigor, la fertilidad femenina y la tasa de transmisión del gen emc,e) seleccionar las líneas de descendencia.
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E09175998.
Solicitante: INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE.
Inventor/es: BUDAR, FRANCOISE, PELLETIER, GEORGES, RENARD, MICHEL, PRIMARD-BRISSET,CATHERINE, DELOURME,RÉGINE, POUPARD,JEAN-PIERRE, HORVAIS,RAYMONDE.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A01H1/02 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA. › A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS. › A01H 1/00 Procedimientos de modificación de los genotipos (A01H 4/00 tiene prioridad). › Métodos o aparatos de hibridación; Polinización artificial.
- A01H1/06 A01H 1/00 […] › Procedimientos de mutación, p. ej. tratamientos por productos químicos o irradiaciones (mutaciones específicas preparadas por ingeniería genética sobre celulas o tejidos vegetales C12N 15/00).
- A01H5/00 A01H […] › Angiospermas,es decir, plantas con flores, caracterizadas por sus partes vegetales; Angiospermas caracterizadas de forma distinta que por su taxonomía botánica.
- A01H5/10 A01H […] › A01H 5/00 Angiospermas,es decir, plantas con flores, caracterizadas por sus partes vegetales; Angiospermas caracterizadas de forma distinta que por su taxonomía botánica. › Semillas.
- C12N15/11 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
PDF original: ES-2394990_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Procedimiento de producción de líneas restauradoras doble cero de Brassica napus con un buen valor agronómico.
La invención se refiere a un procedimiento para producir líneas restauradoras doble cero de Brassica napus para esterilidad masculina citoplásmica Ogura (emc) que presentan una introgresión del rábano portadoras del gen restaurador Rfo suprimido del alelo Pgi-2 de rábano y recombinado con el gen PGI-2 de Brassica oleracea, y que tiene un buen valor agronómico caracterizado por la fertilidad femenina, una buena tasa de transmisión de Rfo y un gran vigor vegetativo. La invención se refiere también a un procedimiento de formación de semillas híbridas de Brassica napus y su descendencia y para la utilización de marcadores para la selección.
Las líneas restauradoras de cultivo para el sistema de esterilidad masculina citoplásmica (emc) Ogu-INRA en semillas de colza (Brassica napus L.) ha sido un objetivo importante durante los últimos años. El retrocruzamiento común y el cultivo genealógico fueron necesarios para mejorar su fertilidad femenina y para obtener líneas restauradoras doble cero. Las denominadas variedades "doble cero" son las que tienen poco ácido erúcico en el aceite y pocos glucosinolatos en la harina sólida que queda tras la extracción del aceite. Sin embargo, algunas dificultades que aún se pueden encontrar en el cultivo de estas líneas (reestructuraciones por introgresión, posible enlace con rasgos negativos) debido al gran tamaño de la introgresión del rábano.
El objetivo en el contexto de la presente invención es el de proporcionar una nueva y mejorada línea restauradora doble cero con un buen valor agronómico.
Este objetivo se consigue mediante un nuevo procedimiento de producción de una línea restauradora doble cero recombinada para la emc Ogu-INRA en semillas de colza.
La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de líneas restauradoras doble cero de Brassica napus para esterilidad masculina citoplásmica (emc) Ogura que presentan introgresión en el rábano portadoras del gen restaurador Rfo suprimido del alelo Pgi-2 del rábano y recombinado con el gen Pgi-2 de Brassica oleracea, y que tiene un buen valor agronómico caracterizado por la fertilidad femenina, una buena tasa de transmisión de Rfo y un gran vigor vegetativo, incluyendo dicho procedimiento las etapas siguientes:
a) cruzar líneas emc doble cero de Brassica napus primaveral que comprende una inserción suprimida de rábano con la línea doble cero de Drakkar primaveral para formar plantas heterocigóticas restauradas de Brassica napus,
b) irradiar antes de la meiosis las plantas heterocigóticas restauradas obtenidas en la etapa a) con radiación de rayos gamma,
c) cruzar el polen de las flores obtenido en la etapa b) con la línea Wesroona de primavera emc doble cero,
d) probar en la descendencia el vigor, la fertilidad femenina y la tasa de transmisión del gen emc,
e) seleccionar líneas de descendencia.
En la presente invención, el término "línea (s) " significa una planta que es esencialmente homocigótica y que es reproducible por autopolinización.
Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la dosis de radiación en la etapa b) es 65 Gray durante 6 min.
Como ilustración del procedimiento según la presente invención, la línea emc doble cero de Brassica napus primaveral de la etapa a) es R211.
La R211 es una línea restauradora primaveral INRA.
La Drakkar es una variedad francesa de primavera registrada.
La Wesroona es una variedad australiana de primavera registrada.
Según una forma de realización ventajosa del procedimiento según la presente invención, la prueba se realiza con la combinación de cinco marcadores seleccionados de entre PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon y CP418.
La presente invención permite la obtención de líneas restauradoras doble cero de Brassica napus para Ogura emc que presentan una inserción Rfo suprimida del alelo Pgi-2 de rábano y recombinada con el gen Pgi-2 de Brassica oleracea, y que tiene un buen valor agronómico caracterizada por la fertilidad femenina, una buena tasa de transmisión de Rfo y un gran vigor vegetativo.
Ventajosamente, las líneas restauradoras doble cero presentan una combinación única de cinco marcadores seleccionados de entre PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon y CP418.
La presente invención permite la formación de una ilustración, plantas híbridas de Brassica napus y de su descendencia obtenidas por las etapas siguientes: a) proporcionar una línea restauradora producida según la reivindicación 1 y cultivada para ser homocigótica, b) utilizar dicha línea restauradora en un campo de producción de híbridos como el polinizador, c) utilizar plantas estériles emc en un campo de producción de híbridos como la planta de productora de semillas híbridas, y
d) recolectar la semilla híbrida de la planta masculina estéril. Las semillas de la planta Brassica obtenidas por los procedimientos según la presente invención se describen también en la presente memoria.
En particular, en la presente memoria se describen las semillas de Brassica napus depositadas en NCIMB Limited, 23 St Machar Drive, Aberdeen, Escocia, AB24 3RY, Reino Unido, el 4 de julio de 2003, con el número de referencia NCIMB41183.
También se describe en la presente memoria la utilización de al menos cuatro marcadores PGIol, PGIint, BolJon y CP418, para la caracterización de líneas restauradoras recombinadas de Brassica napus para Ogura emc que presentan una inserción Rfo suprimida del alelo Pgi-2 de rábano y recombinada con el gen Pgi-2 de Brassica oleracea, y que tiene un buen valor agronómico caracterizado por la fertilidad femenina, una buena tasa de transmisión de Rfo y un alto vigor vegetativo.
Preferentemente, la combinación es de cinco marcadores PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon y CP418. Dichos marcadores se representan en las siguientes figuras y en el listado de secuencias para la línea R2000. Ventajosamente, dichos marcadores son los siguientes:
- El marcador PGIol que se amplía utilizando los cebadores: PGIol U y L PGIol: (PGIol U: 5'TCATTTGATTGTTGCGCCTG3'; PGIol L: 5'TGTACATCAGACCCGGTAGAAAA3 ')
- El marcador PGIint que se amplía utilizando los cebadores: PGIint U y PGIint L:
(PGIint U: 5'CAGCACTAATCTTGCGGTATG3'; PGIint L: 5'CAATAACCCTAAAAGCACCTG3')
- El marcador PGIUNT que se amplía utilizando los cebadores: PGIol U y PGIint L: (PGIol U: 5TCATTTGATTGTTGCGCCTG3'; PGIint L: 5'CAATAACCCTAAAAGCACCTG3')
- El BolJon marcador que se amplía utilizando los cebadores: BolJon U y BolJon L:
(BolJon U: 5'GATCCGATTCTTCTCCTGTTG3'; BolJon L: 5'GCCTACTCCTCAAATCACTCT3')
- El marcador CP418 que se amplía utilizando los cebadores: SG129 U y L pCP418: (SG129 U: cf.Giancola et al., 2003 Theor. Appl. Genet. ( en imprenta ) pCP418 L: 5'AATTTCTCCATCACAAGGACC3') Preferentemente, los marcadores utilizados en el procedimiento de la presente invención tienen las siguientes
secuencias: marcador PGIol R2000: marcador PGIUNT R2000:
marcador PGIint R2000:
marcador BoIJon R2000:
marcador CP418L R2000:
En el dibujo adjunto a continuación, se utilizan las siguientes abreviaturas:
Dra. Drakkar
Rel-15-1, E38, R15 R2000
Hete, Hel, R211.Drakkar R211 heterocigótico* Drakkar
Darm Darmor
Bol: Brassica oleracea
Bra, B.rap: Brassica rapa
GCPA18-A19, Wes, Aust: Wesroona
Sam, SamlPGIolSunt5 Samourai
RRH1, ba2c RRH1
rav, N.WR Brassica napus híbrida * Rábano silvestre
- La figura 1 ilustra la irradiación con rayos gamma y la producción de F2.
- La figura 2 ilustra semillas colocadas en 'R211' y 'R2000'.
- La figura 3 muestra el número de semillas por vaina de diferentes líneas.
-La figura 4 ilustra la localización del cebador PGIol en el segmento de la secuencia de PGI de la base de 5 datos. En esa figura:
PGIol: - cebador PGIol U (nombrado en SGAP: BnPGIch 1 U)
- cebador PGIol L (nombrado en SGAP: Bn PGIch 1 L) PGIint: - cebador PGIint U
- cebador PGIint L (está fuera de la secuencia) .
-La figura 5 ilustra la electroforesis en gel del gen PGI-2 (PGIol) , marcador de RCP y SG34, marcador de RCP cerca de Rfo.
- La figura 6 ilustra el segmento Pgi-2 de ADN ampliado por RCP con cebadores PGIol.
- La figura 7 ilustra la digestión del producto de RCP PGIol por MseI. En esa figura:
Sam y Darm tienen una banda de 75 pb. Drak, R211.Dk y R2000 mostró una banda de 70pb (acrilamida al 15%) . 8 fue similar a Samourai (75 pb) ; la mezcla con Drakkar (70 pb) permitió la visualización... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Procedimiento de producción de líneas restauradoras doble cero de Brassica napus para la esterilidad masculina citoplásmica (emc) Ogura que presentan introgresión de rábano portadora del gen restaurador Rfo suprimido del alelo Pgi-2 de rábano y recombinado con el gen Pgi-2 de Brassica oleracea, y que presentan un buen valor agronómico caracterizado por la fertilidad femenina, una buena tasa de transmisión de Rfo y un vigor vegetativo elevado, incluyendo dicho procedimiento las etapas siguientes:
a) cruzar las líneas emc doble cero de Brassica napus de primavera que comprenden una inserción suprimida de rábano en cada lado de Rfo, habiendo perdido dichas líneas emc doble cero de Brassica napus de primavera la expresión de isoenzima del alelo Pgi-2 del genoma del rábano y del alelo Pgi-2 del genoma de B. oleracea, con la línea doble cero de Drakkar de primavera para formar plantas restauradas heterocigóticas de Brassica napus, b) irradiar antes de la meiosis las plantas restauradas heterocigóticas obtenidas en la etapa a) con irradiación de rayos gamma, c) cruzar el polen de las flores obtenidas en la etapa b) con la línea de Wesroona de primavera emc doble cero,
d) someter a prueba la descendencia para el vigor, la fertilidad femenina y la tasa de transmisión del gen emc, e) seleccionar las líneas de descendencia.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la dosis de radiación en la etapa b) es de 65 Gray durante 6 min.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la prueba se realiza con la combinación de cinco marcadores seleccionados de entre PGIol, PGIint, BolJon y CP418, presentando dichos marcadores las secuencias de SEC ID nº 1, SEC ID nº 3, SEC ID nº 4 y SEC ID nº 5 respectivamente,
en el que:
- el marcador PGIol presenta una banda de 248 pb,
- el marcador pGIint presenta una banda de Brassica de 870 pb,
- el marcador BolJon presenta una banda de rábano de 630 pb, una banda de Brassica oleracea de 950 pb y una banda de Brassica rapa de 870 pb, y
- el marcador CP418 presenta una banda de Brassica de 670 pb, en homocigotos de dichas líneas restauradoras.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la prueba se realiza con la combinación de cinco marcadores seleccionados de entre PGIol, PGIUNT, PGIint, BolJon y CP418, presentando dichos marcadores las secuencias de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 3, SEC ID nº 4 y SEC ID nº 5, respectivamente,
en el que:
- el marcador pGlol presenta una banda de 248 pb,
- el marcador pGIint presenta una banda de Brassica de 870 pb,
- el marcador pGiUNT presenta una banda de Brassica de 980 pb,
- el marcador BolJon presenta una banda de rábano de 630 pb, una banda de Brassica oleracea de 950 pb y una banda de Brassica rapa de 870 pb, y
-el marcador CP418 presenta una banda de 670 pb, en homocigotos de dichas líneas restauradoras.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la prueba se realiza con al menos el marcador BolJon que presenta la secuencia: SEC ID nº 4 y en el que el marcador BolJon presenta una banda de rábano de 630 pb, una banda de Brassica oleracea de 950 pb y una banda de Brassica rapa de 870 pb en homocigotos de dicha línea restauradora.
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