Precipitación con polielectrolito y purificación de anticuerpos.

Método de purificación de anticuerpos, que comprende:

(a) ajustar la acidez o la concentración de sales de una mezcla que contiene un anticuerpo en la que elanticuerpo deriva de un fluido de cultivo celular y el fluido de cultivo celular deriva de un cultivo celular demamífero;

(b) añadir un polielectrolito policatiónico cargado positivamente seleccionado entre poliarginina y polilisina a lamezcla, mediante lo cual se forma un precipitado que comprende el polielectrolito policatiónico cargadopositivamente e impurezas seleccionadas entre agregados de proteínas, fragmentos de proteínas,proteínas de célula huésped, insulina, gentamicina y ADN; y

(c) separar el precipitado de la mezcla que comprende el anticuerpo.

Precipitación con polielectrolito y purificación de anticuerpos [0001] CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a métodos para purificar proteínas.

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ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La purificación económica a gran escala de proteínas es un importante problema creciente para la industria de la biotecnología. En general, las proteínas se producen mediante el cultivo celular utilizando líneas celulares de mamífero o bacterianas diseñadas para producir la proteína de interés mediante la inserción de un plásmido recombinante que contiene el gen para esa proteína. Dado que las líneas celulares utilizadas son organismos vivos, deben alimentarse con un medio de crecimiento complejo, que contiene azúcares, aminoácidos y factores de crecimiento, normalmente suministrados a partir de preparaciones de suero animal. La separación de la proteína deseada de la mezcla de compuestos suministrados a las células y de los subproductos de las propias células hasta una pureza suficiente para su uso como producto terapéutico humano plantea un tremendo desafío.

Las proteínas terapéuticas recombinantes se producen normalmente en varias líneas celulares de huésped mamífero que incluyen mieloma murino NS0 y células de ovario de hámster chino (CHO) (Anderson, D.C y Krummen, L. (2002) Curr. Opin. Biotech. 13: 117-123; Chu, L. y Robinson, D.K. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:180-187) . Cada línea celular presenta ventajas y desventajas en términos de productividad y las características de las proteínas producidas por las células. La elección de las líneas celulares de producción comercial sopesan a menudo la necesidad de una mayor productividad con la capacidad de proporcionar atributos de calidad del producto requeridas para un producto determinado. Una clase importante de proteínas recombinantes terapéuticas que a menudo requieren procesos de titulación elevada son los anticuerpos monoclonales. Algunos anticuerpos monoclonales necesitan funciones efectoras, mediadas a través de la región de Fc, para producir sus funciones biológicas. Un ejemplo es rituximab (RITUXAN®, Genentech, Inc. y Biogen-Idec) , un anticuerpo monoclonal quimérico que se une a CD-20 de la superficie celular en el agotamiento de células B (Cartron et al (2002) Blood 99: 754-758; Idusogie et al (2000) J. Immunol. 164: 4178-4184) . Otros anticuerpos, tales como bevacizumab (AVASTIN ™, Genentech, Inc.) , un anticuerpo anti-VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) humanizado, no requieren de las funciones efectoras de Fc para su actividad.

Los avances en las técnicas de fermentación y cultivo celular han aumentado ampliamente los títulos de proteínas diana en el fluido de cultivos. Este incremento en la eficacia cascada arriba ha llevado a un cuello de botella en el procesado cascada abajo en la etapa de recogida celular. La recogida celular o la purificación del fluido del cultivo celular recogido es un proceso importante en casi todas las purificaciones cascada debajo de los productos de base biotecnológica. Cuando el producto es interno a las células, la recogida celular se utiliza para disminuir el volumen líquido de las células a procesar en las etapas de extracción de producto. Cuando el producto es extracelular, se utiliza la recogida celular para separar el producto de las células y el residuo celular, por ejemplo, el aislamiento de un anticuerpo extracelular del cultivo celular de mamífero (Anthony S. Lubiniecki, Ed. (1990) Large-Scale Mammalian Cell Culture Technology, Marcel Dekker; Hansjoerg Hauser, Roland Wagner, Eds. (1997) Mammalian Cell Biotechnology in Protein Production, Walter Gruyter Publishing) .

Los procedimientos para la purificación de proteínas a partir del residuo celular dependen inicialmente del sitio de expresión de la proteína. Se puede provocar que algunas proteínas se secreten directamente desde la célula al medio de crecimiento circundante; otras se producen intracelularmente. Para estas últimas proteínas, la primera etapa del proceso de purificación implica la lisis de la célula, que se puede realizar mediante varios métodos, incluyendo el corte mecánico, choque osmótico o tratamientos enzimáticos. Dicha alteración libera el contenido completo de la célula en el homogenato y además, produce fragmentos subcelulares que son difíciles de eliminardebido a su tamaño pequeño. Éstos se eliminan en general mediante centrifugación diferencial o mediante filtración. El mismo problema surge, aunque a menor escala, con proteínas secretadas directamente debido a la muerte natural de las células y la liberación de proteínas intracelulares de la célula huésped en el transcurso del desarrollo de producción de proteínas.

Durante la purificación de anticuerpos terapéuticos, se deben eliminar impurezas que incluyen proteínas de las células huésped, variantes de productos, ADN de las células huésped, moléculas pequeñas, contaminantes relacionados con el proceso, endotoxinas y partículas virales (Fahrner, R.L. et al (2001) Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 18:301-327) . Las técnicas de purificación utilizadas deben ser escalables, eficientes, rentables, fiables y que cumplan los requisitos de pureza rigurosos del producto final. Las técnicas de purificación actuales implican habitualmente múltiples separaciones cromatográficas que utilizan modos de separación ortogonales. Un proceso habitual podría incluir algunas de las siguientes etapas: precipitación (US 7169908) , diálisis, electroforesis, ultrafiltración, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de intercambio aniónico y/o cromatografía de interacción hidrofóbica. Las etapas de cromatografía en columna convencionales son

eficaces y fiables, pero en general tiene un rendimiento de producto bajo (kg procesado/h) . Dado que los anticuerpos monoclonales son cada vez más utilizados, es necesaria una producción a escala de proceso más eficiente.

Las técnicas de cromatografía explotan las propiedades químicas y físicas de las proteínas para conseguir un grado elevado de purificación. Estas propiedades químicas y físicas incluyen habitualmente el tamaño, punto isoeléctrico, distribución de carga, sitios hidrofóbicos y afinidad por ligandos (Janson, J.C. y L. Ry den (eds.) . (1989) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications. VCH Publishers, Inc., New York) . Los diversos modos de separación de cromatografía incluyen: cromatografía de intercambio iónico, “chromatofocusing”, filtración en gel (exclusión por tamaño) , interacción hidrofóbica, fase inversa, y afinidad. La cromatografía de intercambio iónico (IEX) , incluyendo cromatografía de intercambio aniónico e intercambio catiónico separa los analitos (por ejemplo, proteínas) por las diferencias de sus cargas netas en superficie. IEX es una herramienta principal para la separación de proteínas expresadas de los residuos celulares y otras impurezas. Actualmente, la IEX es una de las técnicas más frecuentemente utilizadas para la purificación de proteínas, péptidos, ácidos nucleicos y otras biomoléculas cargadas, ofreciendo una resolución elevada y separaciones de grupos con una capacidad de recarga elevada. La técnica es capaz de separar especies moleculares que presentan diferencias pequeñas en sus propiedades de carga, por ejemplo, dos proteínas que difieren en un aminoácido cargado. Estas características hacen que IEX sea adecuado para etapas de captura, purificación de intermedio o refinamiento en un protocolo de purificación y la técnica se utiliza desde purificación y análisis a microescala a purificación de kilogramos de producto.

Las técnicas de cromatografía son fiables, pero la capacidad y el rendimiento pueden ser problemáticos para aplicaciones a gran escala. Las etapas de cromatografía en columna convencionales son efectivas y fiables, pero en general el rendimiento de producto es bajo (kg procesado/h) . Dado que las proteínas recombinantes son cada vez más utilizadas, es necesaria una producción a escala de proceso más eficiente. El rendimiento de una etapa de cromatografía está limitado normalmente por la capacidad de la resina de cromatografía para la proteína de interés. Con una mayor carga de proteína en la columna, la resolución de la proteína de interés con respecto a las impurezas disminuye frecuentemente.

Se sabe que los polielectrolitos forman complejos con proteínas que toman las formas de complejos solubles (Dellacherie, E. (1991) Am. Chem. Soc., Div. Polym. Chem. Prepr. 32 (1) :602) , precipitados amorfos (Mattiasson et al (1998) Polym. Plast. Technol. Eng. 37 (3) :303-308; Clark et al (1987) Biotech. Progress 3 (4) :241; Fisher et al (1988)... [Seguir leyendo]

1. Método de purificación de anticuerpos, que comprende: 5

(a) ajustar la acidez o la concentración de sales de una mezcla que contiene un anticuerpo en la que el anticuerpo deriva de un fluido de cultivo celular y el fluido de cultivo celular deriva de un cultivo celular de mamífero;

(b) añadir un polielectrolito policatiónico cargado positivamente seleccionado entre poliarginina y polilisina a la

mezcla, mediante lo cual se forma un precipitado que comprende el polielectrolito policatiónico cargado positivamente e impurezas seleccionadas entre agregados de proteínas, fragmentos de proteínas, proteínas de célula huésped, insulina, gentamicina y ADN; y

(c) separar el precipitado de la mezcla que comprende el anticuerpo.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que el polielectrolito policatiónico cargado positivamente tiene un peso molecular de 2.500 a 225.000 Da.

3. Método, según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se selecciona entre un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo, y una proteína de fusión 20

4. Método, según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD20 o un anticuerpo anti-CD22.

5. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo deriva del fluido de cultivo celular

recogido mediante la inmovilización de la proteína en un adsorbente de proteína A. 25

6. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo deriva del cultivo celular recogido mediante cromatografía de intercambio catiónico.

7. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo se captura directamente del fluido 30 de cultivo celular recogido.

8. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cultivo celular de mamífero es un cultivo de células de ovario de hámster chino.

9. Método, según la reivindicación 1, en el que se añade a la mezcla más de un polielectrolito policatiónico cargado positivamente.

10. Método, según la reivindicación 1, en el que la concentración del polielectrolito policatiónico cargado positivamente está entre 0, 01% y 1% peso/volumen en la mezcla que contiene la proteína. 40

11. Método, según la reivindicación 1, en el que el precipitado se forma en modo discontinuo o modo continuo.

12. Método, según la reivindicación 1, en el que el precipitado se separa de la mezcla mediante centrifugación o

filtración. 45