Polipéptidos que tienen actividad de celobiohirolasa I y polinucleótidos que codifican los mismos.

Polipéptido con actividad de celobiohidrolasa I, seleccionado del grupo consistiendo en:

(a) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad con los aminoácidos 1a 457 de SEC ID n.º: 8,

(b) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad con el polipéptidocodificado por los nucleótidos 1 a 1371 de SEC ID n.º: 7.

Polipéptidos que tienen actividad de celobiohirolasa I y polinucleótidos que codifican los mismos Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a polipéptidos con actividad de celobiohidrolasa I (también llamada CBH I o CBH 1) y polinucleótidos con una secuencia de núcleotidos que codifica los polipéptidos. La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células huésped que comprenden los constructos de ácidos nucleicos al igual

que métodos para producir y utilizar los polipéptidos.

Antecedentes de la invención [0002] La celulosa es una materia prima industrial importante y una fuente de energía renovable. La estructura física y la morfología de la celulosa nativa son complejas y los detalles finos de su estructura han sido difíciles de determinar experimentalmente. No obstante, la composición química de la celulosa es simple, consiste en residuos de D-glucosa enlazados por enlaces beta-1, 4-glicosídicos para formar polímeros lineales con longitud de cadenas de más de 10 000 residuos glicosídicos.

Para ser eficaz, la digestión de la celulosa requiere diferentes tipos de enzimas que actúan cooperativamente. Al menos tres categorías de enzimas son necesarias para convertir celulosa en glucosa: endo (1, 4) -beta-D-glucanasas (EC 3.2.1.4) que cortan al azar las cadenas de celulosa; celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) que disocian unidades de celobiosil de los extremos de la cadena de celulosa y beta-glucosidasas (EC 3.2.1.21) que convierten celobiosa y celodextrinas solubles en glucosa. Entre estas tres categorías de enzimas implicadas en la biodegradación de celulosa, las celobiohidrolasas son las enzimas clave para la degradación de celulosa cristalina nativa.

Exo-celobiohidrolasas (celobiohidrolasa I o CBH I) se refieren a las celobiohidrolasas que degradan celulosa mediante hidrólisis de la celobiosa del extremo no reducido de las cadenas de polímero de celulosa.

Es un objeto de la presente invención proporcionar polipéptidos mejorados con actividad de celobiohidrolasa I y polinucleótidos que codifiquen los polipéptidos. Los polipéptidos mejorados pueden tener actividad específica mejorada y/o estabilidad mejorada, en particular termoestabilidad mejorada. Los polipéptidos también pueden tener una capacidad mejorada para resistir a la inhibición por celobiosa.

Resumen de la invención [0006] En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido con actividad de celobiohidrolasa I, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad con los aminoácidos 1 a 457 de SEC ID n.º: 8,

(b) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad con el polipéptido codificado por los nucleótidos 1 a 1371 de SEC ID n.º: 7.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la invención.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un constructo de ácidos nucleicos que comprende la 50 secuencia de nucleótidos, que codifica el polipéptido de la invención, operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped adecuado.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos de la invención.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos de la invención.

En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir un polipéptido de la invención, el 60 método comprende:

(a) cultivo de una célula huésped recombinante de la invención bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y

(b) recuperación del polipéptido.

En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción in situ de un polipéptido de la invención, el método comprende:

(a) cultivo una célula huésped recombinante de la invención bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y

(b) puesta en contacto del polipéptido con un sustrato deseado sin recuperación previa del polipéptido.

Otros aspectos de la presente invención serán aparentes de la descripción que se realizará más adelante y de las reivindicaciones anexas Definiciones [0014] Antes de discutir la presente invención en detalles adicionales, los siguientes términos y convenios serán definidos primeramente:

Polipéptido sustancialmente puro: en el presente contexto, el término "polipéptido sustancialmente puro" significa una preparación de polipéptido que contiene como mucho un 10% en peso de otro material polipeptídico con el cual es originalmente asociado (porcentajes inferiores de otro material polipeptídico son preferidos, por ejemplo como mucho un 8% en peso, como mucho un 6% en peso, como mucho un 5% en peso, como mucho un 4% como mucho 3% en peso, como mucho un 2% en peso, como mucho un 1% en peso, y como mucho un 1/2 % en peso) . Así, se prefiere que el polipéptido sustancialmente puro sea al menos un 92% puro, es decir que el polipéptido constituya al menos un 92% en peso del material polipeptídico total presente en la preparación, y porcentajes más altos son preferidos tales como al menos un 94% puro, al menos un 95% puro, al menos un 96% puro, al menos un 96% puro, al menos un 97% puro, al menos un 98% puro, al menos un 99%, y como mucho un 99.5% puro. Los polipéptidos descritos aquí están preferiblemente en forma sustancialmente pura. En particular, se prefiere que los polipéptidos descritos aquí estén en "forma esencialmente pura", es decir que la preparación de polipéptido esté esencialmente libre de otro material polipeptídico con el cual es originalmente asociado. Este puede ser realizado, por ejemplo, por preparación del polipéptido mediante métodos recombinantes bien conocidos. Aquí, el término "polipéptido sustancialmente puro" es sinónimo de los términos "polipéptido aislado" y "polipéptido en forma aislada". Actividad de Celobiohidrolasa I: El término “actividad de celobiohidrolasa I” es definido aquí como una actividad de celulosa 1, 4-beta-celobiosidasa (también llamada exo-glucanasa, exo-celobiohidrolasa o 1, 4-beta-celobiohidrolasa) , como se define en la clase enzimática EC 3.2.1.91, que cataliza la hidrólisis de enlaces de 1, 4-beta-D-glucosídico en celulosa y celotetraosa, liberando celobiosa de los extremos no reductores de las cadenas.

Para fines de la presente invención, la actividad de celobiohidrolasa I puede ser determinada según el procedimiento descrito en ejemplo 2.

En una forma de realización, la actividad de celobiohidrolasa I puede ser determinada según el procedimiento descrito en Deshpande MV et al., Methods in Enzymology, pp. 126-130 (1988) : "Selective Assay for Exo-1, 4-Beta-Glucanases". Según este procedimiento, una unidad de actividad de celobiohidrolasa I (actividad de escisión de enlace aglucónico) es definida como 1, 0 μmol de p-nitrofenol producido por minuto a 50°C, pH 5, 0.

Los polipéptidos de la presente invención deberían preferiblemente tener como mínimo un 20% de la actividad de celobiohidrolasa I de un polipéptido que en una secuencia de aminoácidos de SEC ID n.º:8. En una forma de realización preferida particular, los polipéptidos deberían tener al menos un 40%, tal como al menos un 50%, preferiblemente al menos un 60%, tal como al menos un 70%, más preferiblemente al menos un 80%, tal como al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, tal como acerca de o al menos un 100% de la actividad de celobiohidrolasa I del polipéptido que consiste en los aminoácidos 1 a 457 de SEC ID n.º:8.

Identidad: en el presente contexto, la homología entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos es descrita por el parámetro "identidad".

Para fines de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos es determinado usando el programa FASTA incluido en la versión 2.0x del paquete FASTA (véase W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988) , "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448 ; and W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98) . La matriz de puntuación usada fue BLOSUM50, penalización del espacio fue -12, y penalización de extensión del espacio fue -2.

El grado de identidad entre... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido con actividad de celobiohidrolasa I, seleccionado del grupo consistiendo en:

(a) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad con los aminoácidos 1 a 457 de SEC ID n.º: 8,

(b) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad con el polipéptido codificado por los nucleótidos 1 a 1371 de SEC ID n.º: 7. 10

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad, más preferiblemente al menos un 95% de identidad, con los aminoácidos 1 a 457 de SEC ID n.º: 8.

3. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que consiste en los aminoácidos 1 a 457 de SEC ID n.º: 8. 15

4. Polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de nucleótidos definida en la reivindicación 4 operativamente 20 enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped adecuado.

6. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos definido en la reivindicación 5.

7. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos definido en la reivindicación 5. 25

8. Método para producir un polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, el método comprende:

(a) cultivar una célula huésped recombinante tal y como se define en la reivindicación 7 bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y 30

(b) recuperar el polipéptido.

9. Método para la producción in situ de un polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, el

método comprende: 35

(a) cultivar una célula huésped recombinante tal y como se define en la reivindicación 7 bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y

(b) poner en contacto el polipéptido con un sustrato deseado sin recuperación previa del polipéptido. 40

10. Método para producir etanol a partir de biomasa, que comprende poner en contacto la biomasa con el polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

11. Uso del polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para producir etanol. 45

12. Planta transgénica, parte de planta o célula vegetal, que tiene incorporado en el genoma de la planta huésped uno o más constructos de expresión que codifican un polipéptido con actividad de celobiohidrolasa I tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

13. Composición de detergente que comprende un surfactante y el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3.