Polipéptidos con actividad de beta-glucosidasa y polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos.

Polipéptido aislado con actividad de beta-glucosidasa, seleccionado de un polipéptido que consiste en una secuenciade aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad con aminoácidos 20 a 863 de la SEC ID nº: 2.

Polipéptidos con actividad de beta-glucosidasa y polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos Antecedentes de la invención

Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a polipéptidos aislados con actividad de beta-glucosidasa y polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células huésped que comprenden tanto los polinucleótidos como los métodos para producir y usar los polipéptidos.

Descripción de las técnicas relacionadas [0002] La celulosa es un polímero de la glucosa de azúcar simple unida covalentemente por enlaces beta-1, 4. Muchos microorganismos producen enzimas que hidrolizan beta-glucanos. Estas enzimas incluyen endoglucanasas, celobiohidrolasas y beta-glucosidasas. Las endoglucanasas digieren el polímero de celulosa en lugares aleatorios, exponiéndolo al ataque por parte de celobiohidrolasas. Las celobiohidrolasas liberan secuencialmente moléculas de celobiosa de los extremos del polímero de celulosa. La celobiosa es un dímero de glucosa de enlace beta 1, 4 hidrosoluble. Las beta-glucosidasas hidrolizan celobiosa a glucosa.

La conversión de materias primas celulósicas en etanol tiene como ventajas la disponibilidad de grandes cantidades de materia prima, la conveniencia de evitar la quema o el vertido de los materiales y la limpieza del combustible de etanol. La madera, residuos agrícolas, los brotes herbáceos y los residuos sólidos municipales han sido considerados materias primas para la producción de etanol. Estos materiales consisten principalmente en celulosa, hemicelulosa y lignina. Una vez que la celulosa se convierte en glucosa, esta es fácilmente fermentada a etanol usando levadura. Ya que la glucosa se fermenta fácilmente a etanol usando una variedad de levaduras mientras que la celobiosa no, cualquier celobiosa restante al final de la hidrólisis representa una pérdida de rendimiento del etanol. Es más, la celobiosa es un inhibidor potente de endoglucanasas y celobiohidrolasas. La acumulación de celobiosa durante la hidrólisis es extremadamente indeseable en la producción de etanol.

La acumulación de celobiosa ha sido un problema importante en la hidrólisis enzimática porque los microorganismos productores de celulasa pueden producir poca beta-glucosidasa. La baja cantidad de beta-glucosidasa produce un déficit de la capacidad para hidrolizar la celobiosa a glucosa. Se han utilizado diferentes métodos para aumentar la cantidad de beta-glucosidasa en la conversión de celulosa a glucosa.

Un método es producir beta-glucosidasa usando microorganismos que producen poca celulasa y añadir la betaglucosidasa exógenamente a la endoglucanasa y la celobiohidrolasa para mejorar la hidrólisis. No obstante, las cantidades requeridas son demasiado costosas para un uso comercial de la biomasa en una operación de etanol.

Un segundo método es llevar a cabo la hidrólisis de celulasa simultáneamente con la fermentación de la glucosa usando levadura. Este proceso es conocido como sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) . En un sistema SSF, la fermentación de la glucosa elimina esta de la solución. No obstante, los sistemas SSF están comercialmente disponibles debido a que la temperatura operativa para la levadura de 28 °C es demasiado baja para las condiciones requeridas de 50 °C.

Un tercer método para superar la escasez de beta-glucosidasa es sobreexpresar la beta-glucosidasa en un huésped, aumentando así el rendimiento de la beta-glucosidasa.

Ximenes et al., 1996, Current Microbiology 32: 119-123; Hang y Woodams, 1994, Lebensmittel-Wissenschaft and Technologie 27: 587-589; y Kitpreechavanich et al., Agricultural and Bilogical Quemistr y 50: 1703-1712, revelan la existencia de beta-glucosidasas de Aspergillus fumigatus.

Sería muy ventajoso para la técnica usar beta-glucosidasa termoestable para convertir materiales celulósicos en monosacáridos, disacáridos y polisacáridos y así mejorar la eficacia del proceso.

Es un objeto de la presente invención proporcionar nuevos polipéptidos con actividad de beta-glucosidasa y ácido nucleico que codifiquen los polipéptidos.

Resumen de la invención [0011] La presente invención se refiere a polipéptidos aislados con actividad de beta-glucosidasa seleccionados de un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90% de identidad con los aminoácidos 20 a 863 de la SEC ID nº: 2.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos con actividad de beta-glucosidasa.

La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y células huésped recombinantes que comprenden los polinucleótidos.

La presente invención también se refiere a métodos para producir tales polipéptidos con actividad de betaglucosidasa que comprenden (a) el cultivo de una célula huésped recombinante que comprende un constructo de ácidos nucleicos que, a su vez, comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido en las condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.

La presente invención se refiere además al uso de los polipéptidos con actividad de beta-glucosidasa para convertir materiales celulósicos en monosacáridos, disacáridos y polisacáridos.

Breve descripción de las figuras [0016] Las Figuras 1A y 1B muestran la secuencia de ADN genómico y la secuencia de aminoácidos deducida de una beta

glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEC ID nº: 1 y 2, respectivamente) . El péptido señal predicho aparece subrayado y los intrones en cursiva.

La Figura 2 muestra un mapa de restricción de pAILo1.

La Figura 3 muestra un mapa de restricción de pBANe10.

La Figura 4 muestra un mapa de restricción de pAILo2.

La Figura 5 muestra un mapa de restricción de pEJG97.

La Figura 6 muestra un mapa de restricción de pMJ04.

La Figura 7 muestra un mapa de restricción de pMJ06.

La Figura 8 muestra un mapa de restricción de pMJ09.

La Figura 9 muestra un mapa de restricción de pEJG107.

La Figura 10 muestra la termoestabilidad de la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus a 50°Cy 65°C.

La Figura 11 muestra la termoestabilidad de la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus a 70 °C.

La Figura 12 muestra la hidrólisis de la celobiosa por beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus a 65 °C.

Definiciones [0017] La actividad de beta-glucosidasa: el término "beta-glucosidasa" es definido en la presente como una glucohidrolasa de beta-D-glucósido (E.C. 3.2.1.21) que cataliza la hidrólisis de residuos terminales no reductores de beta-D-glucosa con la liberación de beta-D-glucosa. Para fines de la presente invención, la actividad de betaglucosidasa se determina según el procedimiento básico descrito por Venturi et al., 2002, J. Basic Microbial. 42: 55-66, a menos que se emplearan condiciones diferentes a las descritas aquí. Una unidad de actividad de beta-glucosidasa es definida como 1, 0 μmol de p-nitrofenol producido por minuto a 50 °C usando pH 5 de 4 mM de p-nitrofenol-beta-Dglucopiranósido como sustrato en 100 mM de citrato sódico, Tween-20 al 0, 01%.

Beta-glucosidasa de la familia GH3AA: el término "beta-glucosidasa de la familia GH3AA" es definido en la presente como una hidrolasa glucósida de la familia 3 según Coutinho, P.M. y Henrissat, B., 1999, Carbohydrate enzymes: an integrated database approach, en "Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering", H.J. Gilberto, G. Davies, B. Henrissat y B. Svensson eds., The Royal Socier y of Chemistr y , Cambridge, págs. 3-12.

Los polipéptidos de la presente invención tienen al menos el 20%, preferiblemente al menos el 40%, más preferiblemente al menos el 50%, más preferiblemente al menos el 60%, más preferiblemente al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 80%, incluso más preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, e incluso más preferiblemente al menos el 100% de la actividad de beta-glucosidasa del polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada como los aminoácidos 20 a 863 de la SEC ID nº: 2.

Polipéptido aislado: el término "polipéptido aislado" según se utiliza en este caso se refiere a un polipéptido que es al menos un 20% puro, preferiblemente al menos un 40% puro, más preferiblemente al menos un 60%, puro, incluso más preferiblemente al menos un 80% puro, más preferiblemente al menos 90% puro, e incluso más preferiblemente al menos un 95% puro, como determinada la SDS-PAGE.

Polipéptido substancialmente puro: el término... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido aislado con actividad de beta-glucosidasa, seleccionado de un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad con aminoácidos 20 a 863 de la SEC ID nº: 2. 5

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de identidad con los aminoácidos 20 a 863 de la SEC ID nº: 2.

3. Polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que consiste en los aminoácidos 20 a 863 de la SEC ID nº: 2. 10

4. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que está codificado por el polinucleótido contenido en el plásmido pEJG113 que a su vez está contenido en E. coli NRRL B-30695.

5. Polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cualquiera de las 15 reivindicaciones 1 a 4.

6. Constructo de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido según la reivindicación 5 operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión.

7. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 6.

8. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 6.

9. Método para producir el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende (a) el cultivo de una

célula, que en su forma tipo salvaje es capaz de producir el polipéptido, bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.

10. Método para producir el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende (a) el cultivo de una célula huésped que comprende un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que 30 codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.

11. Método para producir el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende (a) el cultivo de una planta transgénica o una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido con actividad de beta-glucosidasa de la presente invención bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.

12. Método para degradar biomasa que contiene celulosa y semicelulosa, que comprende el tratado de la biomasa con una cantidad eficaz del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y la recuperación de la biomasa degradada.