Variantes de glucósido hidrolasas.

Polipéptido de variante aislada con actividad de glucósido hidrolasa,

que tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 de al menos 90%, preferiblemente al menos 95%, y de la forma más preferible al menos 97%, donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de la SEC ID n.º: 2 en al menos una posición correspondiente a la posición 94 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2, donde la diferencia en al menos una posición es una sustitución en la posición 94 y la variante tiene propiedades mejoradas en comparación con la glucósido hidrolasa progenitora, donde las propiedades mejoradas son seleccionadas del grupo que consiste en perfil de actividad dependiente de la temperatura, termoestabilidad, actividad del pH, estabilidad del pH y especificidad de sustrato, especificidad de producto y estabilidad química.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E12194265.

Solicitante: NOVOZYMES, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 1445 DREW AVENUE DAVIS, CA 95616 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: HARRIS, PAUL, CHERRY,Joel, TETER,SARAH, WARD,CONNIE, JONES,AUBREY, YI,JUNG.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/56 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › que actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2), p. ej. amilasa, galactosidasa, lisozima.
  • C12N9/42 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre los enlaces beta-glucosídicos-1,4, p. ej. celulasa.
  • C12P19/14 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › preparados por acción de una carbohidrasa, p. ej. por acción de la alfa-amilasa.

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Fragmento de la descripción:

Variantes de glucósido hidrolasas [0001] Esta invención fue realizada con el apoyo del Gobierno bajo el Subcontrato de NREL No. ZCO-30017-02, Contrato principal DE-AC36-98GO10337 otorgado por el Departamento de Energía. El gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.

Antecedentes de la invención Campo de la invención [0002] La presente invención se refiere a variantes de una glucósido hidrolasa con una o más propiedades mejoradas en relación a su enzima progenitora, ácidos nucleicos que codifican las variantes, métodos de producción de las variantes y métodos de uso de las variantes.

Descripción de las técnicas relacionadas [0003] La celulosa es un polímero de la glucosa de azúcar simple unido covalentemente por enlaces beta-1, 4. Muchos microorganismos producen enzimas que hidrolizan glucanos betaenlazados. Estas enzimas incluyen endoglucanasas, celobiohidrolasa y beta-glucosidasas. Las endoglucanasas digieren el polímero de celulosa en lugares al azar, abriéndolo al ataque por parte de celobiohidrolasas. Las celobiohidrolasas secuencialmente liberan moléculas de celobiosa de las extremidades del polímero de celulosa. La celobiosa es un dímero de glucosa hidrosoluble con enlace beta-1, 4. Las beta-glucosidasas hidrolizan celobiosa a glucosa.

La conversión de materias primas celulósicas en etanol tiene las ventajas de la disponibilidad inmediata de grandes cantidades de materia prima, la conveniencia de evitar quemar o verter en terrenos los materiales y la limpieza del combustible de etanol. La madera, los residuos agrícolas, los brotes herbáceos y los desperdicios sólidos municipales han sido considerados materias primas para la producción de etanol. Estos materiales principalmente consisten en celulosa, hemicelulosa y lignina. Una vez la celulosa se convierte a glucosa, la glucosa es fácilmente fermentada por levadura en el etanol.

Ståhlberg et al., 1996, J. Mol. Biol. 264: 337-349, describen estudios de actividad y estructuras de cristal de mutantes catalíticamente deficitarios de celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei. Boer and Koivula, 2003, Eur. J.

Biochem. 270: 841-848, revela la relación entre la termoestabilidad y el óptimo de pH estudiado con tipo salvaje y mutante de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei Cel7A.

WO 2004/016760 divulga variantes de una celobiohidrolasa Hypocrea jecorina.

Sería una ventaja en la técnica proporcionar variantes de glucósido hidrolasa con propiedades mejoradas para convertir materiales celulósicos a monosacáridos, disacáridos y polisacáridos. Las propiedades mejoradas incluyen perfiles de actividad alterada dependiente de la temperatura, termoestabilidad, actividad de pH, estabilidad del pH, especificidad de sustrato, especificidad de producto y estabilidad química.

Es un objeto de la presente invención proporcionar variantes de glucósido hidrolasas con propiedades mejoradas en comparación con sus enzimas progenitoras.

Resumen de la invención 50 [0009] La presente invención también se refiere a variantes aisladas de una glucósido hidrolasa genitora, que comprende una sustitución de una o más posiciones correspondiente a las posiciones 21, 94, 157, 205, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2, donde la diferencia en al menos una posición es una sustitución en la posición 94 y la variante tiene propiedades mejoradas en comparación con la glucósido hidrolasa progenitora, donde las propiedades mejoradas son seleccionadas del grupo que consiste en perfil de actividad

dependiente de la temperatura, termoestabilidad, actividad de pH, estabilidad de pH y especificidad de sustrato, especificidad de producto y estabilidad química, y opcionalmente comprende además una sustitución de una o más posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411 y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC IC nº: 2, donde las variantes tienen actividad de glucósido hidrolasa.

La presente invención también se refiere a polipéptidos aislados con actividad de glicósido hidrolasa, donde las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos difieren de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2 en una o varias posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 205, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467, y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2 donde la diferencia en al menos una posición es una sustitución en la posición 94 y la variante tiene propiedades mejoradas en comparación con la glicósido hidrolasa progenitora, donde las propiedades mejoradas son seleccionadas del grupo consistente en perfil de actividad dependiente de la temperatura, termoestabilidad, actividad de pH, estabilidad de pH, y especificidad de sustrato, especificidad de producto, y estabilidad química, y opcionalmente difiere además de una o varias posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411, y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2.

La presente invención se refiere también a secuencias de nucleótidos aisladas que codifican las glucósido hidrolasas variantes o polipéptidos que tienen actividad glucósido hidrolasa y a constructos de ácidos nucléicos, vectores, células huéspedes que comprenden secuencias de nucleótidos.

La presente invención también se refiere a métodos para producir variantes de una glucósido hidrolasa progenitora o polipéptidos con actividad de glucósido hidrolasa en una célula huésped.

La presente invención además se refiere a métodos de uso de las variantes de glucósido hidrolasa en detergentes y en la conversión de celulosa a glucosa.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un mapa de restricción de pAJ052.

La Figura 2 muestra un mapa de restricción de pJC106.

La Figura 3 muestra un mapa de restricción de pAILo1.

La Figura 4 muestra un mapa de restricción de pBANe10.

La Figura 5 muestra un mapa de restricción de pAILo2.

La Figura 6 muestra un mapa de restricción de pCW026.

La Figura 7 muestra un mapa de restricción de pNP776G205R.

La Figura 8 muestra un mapa de restricción de pMJ04.

La Figura 9 muestra un mapa de restricción de pMJ06.

La Figura 10 muestra un mapa de restricción de pMJ09.

La Figura 11 muestra un mapa de restricción de pCW045.

La Figura 12 muestra un mapa de restricción de pSTM01.

La Figura 13 muestra un mapa de restricción de pSMKO3.

La Figura 14 muestra un mapa de restricción de pEJG97.

La Figura 15 muestra la secuencia de ADN genómico y la secuencia de aminoácidos deducida de una betaglucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEC ID n.°: 56 y 57, respectivamente) . El péptido señal predicho está subrayado y los intrones predichos están en cursiva.

La Figura 16 muestra la termoestabilidad de la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus a 50° y 65° C.

La Figura 17 muestra la termoestabilidad de la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus a 70° C.

La Figura 18 muestra la hidrólisis de celobiosa por beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus a 65° C.

La Figura 19 muestra los perfiles de curso temporal de hidrólisis PCS por la cepa de Trichoderma reesei progenitora RutC30 y la variante de expresión de la cepa 776-M57.

Descripción detallada de la invención [0015] La presente invención se refiere a variantes aisladas de una glucósido hidrolasa progenitora, que comprende una sustitución en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 21, 94, 157, 205, 206, 247, 337, 350, 373, 383, 438, 455, 467 y 486 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2, donde la diferencia en al menos una posición es una sustitución en la posición 94 y la variante tiene propiedades mejoradas en comparación con la glucósido hidrolasa progenitora, donde las propiedades mejoradas son seleccionadas del grupo que consiste en perfil de actividad dependiente de la temperatura, termoestabilidad, pH actividad, pH estabilidad y especificidad de sustrato, especificidad de producto y estabilidad química, y opcionalmente difiere además de una o varias posiciones correspondientes a las posiciones 8, 22, 41, 49, 57, 113, 193, 196, 226, 227, 246, 251, 255, 259, 301, 356, 371, 411, y 462 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID nº: 2, donde la variante tiene actividad de glucósido hidrolasa.

Definiciones

El término "glucósido hidrolasa" es definido en la presente como hidrolasas descritas por Coutinho, P.M. y Henrissat, B., 1999, Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach, in "Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering", H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat y B. Svensson eds., The Royal... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Polipéptido de variante aislada con actividad de glucósido hidrolasa, que tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2 de al menos 90%, preferiblemente al menos 95%, y de la forma más preferible al menos 97%, donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere de la SEC ID n.º: 2 en al menos una posición correspondiente a la posición 94 de los aminoácidos 1 a 513 de SEC ID n.º: 2, donde la diferencia en al menos una posición es una sustitución en la posición 94 y la variante tiene propiedades mejoradas en comparación con la glucósido hidrolasa progenitora, donde las propiedades mejoradas son seleccionadas del grupo que consiste en perfil de actividad dependiente de la temperatura, termoestabilidad, actividad del pH, estabilidad del pH y especificidad de sustrato, especificidad de producto y estabilidad química.

2. Polipéptido variante según la reivindicación 1, donde la sustitución en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de SEC ID nº: 2 en una posición correspondiente a la posición 94 es Ser, Ala, Arg o Gln.

3. Polipéptido variante según la reivindicación 1, donde la sustitución en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de SEC ID nº: 2 en una posición correspondiente a la posición 94 es Gly94Ser, Gly94Ala, Gly94Arg o Gly94Gln.

4. Polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el polipéptido variante comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 94 y 226 de los aminoácidos 1 a 513 de SEQ ID n.°:

2.

5. Polipéptido variante según la reivindicación 4, donde la variante comprende las sustituciones Gly94Ser (o Gly94Ala o Gly94Arg o Gly94Gln) + Thr226Ala.

6. Secuencia de nucleótidos aislada que codifica el polipéptido de cualquiera según las reivindicaciones 1-5.

7. Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 6.

8. Vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 7.

9. Célula huésped que comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 6.

10. Método para producir un polipéptido variante con actividad de glucósido hidrolasa, que comprende (a) cultivo de la célula huésped según la reivindicación 9 bajo condiciones adecuadas para la producción de la variante; y (b) recuperación de la variante del medio de cultivo.

11. Composición detergente que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un surfactante.

12. Método para degradar biomasa que contiene celulosa y hemicelulosa, que comprende tratar la biomasa con una cantidad eficaz de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y recuperación de la biomasa degradada.

13. Método según la reivindicación 12, que comprende además tratar la biomasa con una cantidad eficaz de endo-1, 4beta-glucanasa y exo-1, 4-beta-D-glucanasa.

14. Método para degradar biomasa que contiene celulosa y hemicelulosa, que comprende tratar la biomasa con una célula huésped según la reivindicación 9 y recuperar la biomasa degradada.

15. Método según la reivindicación 14, que comprende además tratar la biomasa con una cantidad eficaz de endo-1, 4beta-glucanasa y exo-1, 4-beta-D-glucanasa.


 

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